Island Assay: Um método de alto rendimento para avaliar o comportamento locomotor de Drosophila

- O ensaio da ilha consiste em uma plataforma branca elevada em uma bandeja de água com sabão, coberta por uma caixa transparente com um lado aberto. Uma câmera no topo da caixa registra imagens aéreas da plataforma e luzes são colocadas para garantir uma iluminação uniforme da área.

Para carregar as moscas na arena, bata um frasco contra uma superfície plana para trazer todas as moscas para o fundo. Em rápida sucessão, remova o tampão do frasco, vire o frasco e bata a extremidade aberta do frasco na plataforma para derrubar todas as moscas ao mesmo tempo. Aterrissar na plataforma aciona uma resposta de fuga. Moscas com mobilidade típica podem limpar a plataforma em poucos segundos, ao contrário daquelas com defeitos locomotores.

Os sujeitos ficam confinados à caixa, e aqueles que pousam na água com sabão submergem rapidamente porque o sabão diminui a tensão superficial da água. Para avaliar o comportamento locomotor de diferentes condições, conte as moscas restantes na plataforma após um determinado período de tempo.

Neste protocolo de exemplo, veremos uma configuração do ensaio de ilha compatível com a análise de imagem semiautomatizada.

- Primeiro, prepare um mínimo de três frascos por condição experimental como réplicas biológicas. Cada frasco para injetáveis deve conter aproximadamente 15 moscas do mesmo sexo e idade semelhante. É importante ressaltar que as moscas devem ter asas intactas.

Crie as pastas para armazenar os experimentos. Gere-os em uma estrutura de diretório definida pelas condições e replicações. Se, por exemplo, o experimento tiver dois genótipos com cinco réplicas cada, crie uma pasta principal com a data do experimento e, dentro dessa pasta, crie uma subpasta para cada genótipo. Em seguida, dentro das pastas de genótipo, crie subpastas para cada replicação.

Em seguida, configure o aparelho de teste. Adicione água fria com uma pequena quantidade de sabão à bandeja do banho e posicione a plataforma no meio do banho, se ainda não estiver fixada no banho. Cubra a bandeja e a plataforma com uma caixa transparente.

Para iluminar a plataforma, posicione uma lâmpada fria, como LEDs comuns de 12 volts, acima dela. Além disso, posicione uma webcam conectada a um computador diretamente acima da plataforma.

No computador, abra o software de gravação de imagens. No sistema Menu, selecione a webcam apropriada como dispositivo de captura. Coloque uma mosca morta na ilha para ajustar as configurações de vídeo. Ajuste o brilho, o contraste e a cor no software para que a mosca morta apareça preta contra um fundo branco.

Em seguida, ajuste a configuração do filme com lapso de tempo para salvar os filmes como arquivos AVI. Em seguida, navegue até o diretório onde os dados devem ser salvos e defina o nome do filme. Salve essas alterações.

Para compactação dos dados da imagem, escolha o código Intel IYUV. Defina a velocidade de gravação para um quadro a cada 0,1 segundos e ajuste a taxa de reprodução correspondente para 10 imagens por segundo.

Por fim, vá para a configuração Avançada e selecione Criar uma imagem BNP para cada quadro capturado. Em seguida, navegue até o mesmo diretório que você escolheu para hospedar os arquivos AVI e pressione OK.

Antes de começar, certifique-se de que a ilha esteja vazia e limpa. Em seguida, inicie a gravação na interface de imagem de lapso de tempo do software de gravação de imagem.

Pegue um frasco contendo moscas e bata nele duas ou três vezes para derrubar todas as moscas até o fundo. Em seguida, remova rapidamente o plugue do frasco e bata vigorosamente as moscas na plataforma. Todos eles devem chegar à plataforma mais ou menos ao mesmo tempo.

Dê às moscas até 30 segundos para sair da plataforma. Em seguida, pare a gravação. Se necessário, remova manualmente todas as moscas restantes da plataforma.

Antes de prosseguir para o próximo experimento, certifique-se de redefinir o diretório em que o próximo conjunto de dados deve ser armazenado.