Montagem de cérebros de Drosophila adulta: um método para preparar lâminas para imagens confocais

- Em uma lâmina de microscópio carregada positivamente, cole duas lamínulas com distância suficiente entre elas para criar um espaço para os cérebros da Drosophila serem montados. Sob o microscópio estereoscópico, pipete os cérebros em meio de montagem nesse espaço. A carga negativa do tecido ajudará os cérebros a aderir à carga positiva na superfície da lâmina.

Remova o excesso de meio de montagem para permitir o posicionamento preciso dos cérebros na lâmina em um padrão de grade com os lóbulos antenais voltados para cima e, em seguida, faça a ponte entre as duas lamínulas colando uma terceira lamínula para cobrir os cérebros.

Para preencher a cavidade, coloque o meio de montagem uma gota de cada vez na borda da cavidade e deixe-o se espalhar por movimento capilar para que não perturbe o cérebro.

Sele a cavidade com esmalte e armazene a 20 graus Celsius negativos no escuro para preservar a fluorescência dos tecidos manchados.

No protocolo de exemplo, montaremos cérebros de Drosophila para imagens confocais de neurônios imunomarcados.

- Para montar os cérebros, construa um escorregador de ponte. Posicione duas tampas de base deslizando aproximadamente um centímetro de distância em uma lâmina carregada positivamente. Certifique-se de que o lado carregado positivamente esteja voltado para cima. Em seguida, cole as lamínulas na lâmina com esmalte e deixe o esmalte secar completamente antes de prosseguir.

Em seguida, coloque a lâmina sob um microscópio estéreo e pipete os cérebros em meio no espaço entre as lamínulas. Certifique-se de ajustar a iluminação para melhorar a visualização dos cérebros.

Em seguida, aspire a mídia de montagem extra da lâmina, tomando cuidado para evitar os cérebros. Em seguida, remova o excesso de mídia de montagem restante. Isso permitirá que os cérebros sejam posicionados com mais precisão. Agora, usando fórceps, oriente os cérebros em um padrão de grade com seus lobos antenais voltados para cima.

Em seguida, coloque uma lamínula sobre os miolos e use esmalte para selar as bordas da lamínula superior que estão presas às lamínulas da base.

Agora, carregue a cavidade central com uma nova mídia de montagem gota a gota, permitindo que a mídia seja puxada sob a lamínula por ação capilar. Quando a cavidade estiver preenchida, sele-a completamente com esmalte transparente.