Lesão neural induzida por laser de dois fótons: um método para observar a degeneração e regeneração do axônio em larvas de Drosophila

- Comece montando uma larva limpa e anestesiada sob uma lamínula de vidro com a cabeça erguida. Em seguida, exponha a área de interesse empurrando suavemente a lamínula para rolar a larva e ajustar sua posição. Use imagens confocais para localizar as células neurais da larva. Identifique um axônio específico em uma das células neurais alvo como o local da lesão.

Em seguida, exponha o axônio alvo a um laser de dois fótons com uma potência maior do que a usada para imagens para induzir danos. Um laser de dois fótons é usado devido à sua capacidade de penetrar e localizar com precisão os danos no tecido vivo com danos mínimos ao tecido circundante.

Pare a exposição ao laser imediatamente quando houver dano ao neurônio alvo, resultando em axotomia ou corte do axônio. Por fim, imagine o neurônio lesionado para visualizar sua degeneração e subsequente regeneração nos pontos de tempo desejados.

No protocolo de exemplo, montaremos uma larva para microscopia, induziremos danos aos neurônios sensoriais larvais e rastrearemos a regeneração neural.

- Comece com uma anestesia das larvas. Em uma capela de exaustão, coloque uma placa de vidro de 60 milímetros em uma placa de Petri de plástico de 15 centímetros. Em seguida, dobre um pedaço de papel de seda e coloque-o no prato de vidro. Colocar a placa de ágar uva sobre o tecido após a adição do éter dietílico.

Em seguida, em uma lâmina de vidro, coloque uma gota de óleo halocarbono 27 no centro e coloque uma mancha de graxa a vácuo em cada um dos quatro cantos. Em seguida, use uma pinça para transferir uma larva para a placa de ágar e cubra a placa de vidro para anestesiar a larva. Assim que a lava parar de se mover, transfira-a cuidadosamente para o óleo halocarbônico com a cabeça erguida. Em seguida, coloque uma lamínula sobre a lâmina e pressione-a suavemente até tocar a larva.

Em seguida, use uma força suave para deslizar a lamínula para rolar as células a serem ablacionadas para onde o laser de dois fótons as atingirá mais facilmente. A localização varia dependendo de quais neurônios estão sendo direcionados. Agora prenda a montagem no estágio do microscópio de dois fótons e concentre-se nas células de interesse usando uma objetiva de imersão em óleo de 40x.

No software, alterne para o modo de varredura e carregue o protocolo salvo. Certifique-se de que o orifício esteja totalmente aberto. Em seguida, no modo ao vivo, obtenha uma boa imagem da região de interesse.

Em seguida, pare a varredura ao vivo para que o botão de corte fique disponível. Usando a função de corte, ajuste a janela de varredura para focar a área alvo apenas no local potencial da lesão. Em seguida, abra uma nova janela de imagem. Agora reduza a velocidade de varredura e aumente a intensidade do laser. Em seguida, alterne o botão contínuo para iniciar e parar a verificação. Observe com atenção. Assim que houver um aumento drástico na fluorescência, termine a varredura.

Em seguida, volte para a janela de imagem original e selecione o modo ao vivo e encontre a região que acabou de ser alvo ajustando o foco.

- Uma boa indicação de lesão bem-sucedida é o aparecimento de uma pequena cratera, estrutura em forma de anel ou detritos localizados bem no local da lesão. Se a potência do laser fosse muito alta, uma grande área danificada seria visível, o que pode ser letal.

- Agora remova cuidadosamente a lamínula e transfira a larva ferida para um novo prato com pasta de fermento. Coloque o prato em um prato de 60 milímetros junto com um lenço de papel embebido em ácido propiônico. Em seguida, retorne a placa à temperatura de cultura.

Para imagens subsequentes da larva, use a configuração confocal salva e colete imagens da pilha z com uma objetiva de 25x. Certifique-se de incluir o ponto de normalização para que a regeneração possa ser quantificada.