Triagem para modificações genômicas: um método para identificar mutantes gerados por CRISPR em Drosophila

- Quando os embriões injetados se desenvolverem em adultos G0, cruze todas as moscas individuais para estoques de balanceadores adequados para expandir as linhas editadas F1 CRISPR em potencial e ser capaz de rastrear a herança da modificação genômica. Em seguida, cruze machos F1 solteiros escolhidos aleatoriamente com fêmeas balanceadoras adequadas para poder recuperar a prole se um macho F1 for positivo para a mutação. Uma vez que a cruz tenha sido tomada, transfira o macho F1 para um tubo para triagem.

Para extrair DNA genômico, esmague a mosca com uma ponta de pipeta contendo tampão de extração. Assim que o tecido for quebrado, ejete o líquido. O tampão de extração contém proteinase K, uma enzima que digere proteínas na amostra e é inativada por altas temperaturas.

Agora que o DNA está acessível, prossiga para a triagem de PCR. Por exemplo, use primers projetados para amplificar uma região que inclui a nova sequência. Somente na presença da modificação o segundo primer se ligará e um produto de PCR serão amplificados. No exemplo, veremos moscas sendo criadas e rastreadas por PCR para inserção de uma sequência de transativação substituindo o primeiro éxon do gene sem ramificação