0 visualizações • 3:48 min. • April 30th, 2023
- Quando os embriões injetados se desenvolverem em adultos G0, cruze todas as moscas individuais para estoques de balanceadores adequados para expandir as linhas editadas F1 CRISPR em potencial e ser capaz de rastrear a herança da modificação genômica. Em seguida, cruze machos F1 solteiros escolhidos aleatoriamente com fêmeas balanceadoras adequadas para poder recuperar a prole se um macho F1 for positivo para a mutação. Uma vez que a cruz tenha sido tomada, transfira o macho F1 para um tubo para triagem.
Para extrair DNA genômico, esmague a mosca com uma ponta de pipeta contendo tampão de extração. Assim que o tecido for quebrado, ejete o líquido. O tampão de extração contém proteinase K, uma enzima que digere proteínas na amostra e é inativada por altas temperaturas.
Agora que o DNA está acessível, prossiga para a triagem de PCR. Por exemplo, use primers projetados para amplificar uma região que inclui a nova sequência. Somente na presença da modificação o segundo primer se ligará e um produto de PCR serão amplificados. No exemplo, veremos moscas sendo criadas e rastreadas por PCR para inserção de uma sequência de transativação substituindo o primeiro éxon do gene sem ramificação.
- Quando os embriões nos-Cas9 previamente injetados com o plasmídeo de expressão de RNA guia e o doador substituto se desenvolvem em adultos, cruze as moscas G0 individualmente com as moscas balanceadoras de uma linha apropriada para o alelo alvo. Anestesie a prole F1 de cada cruzamento G0 em uma almofada de dióxido de carbono e escolha aleatoriamente de 10 a 20 machos sob um microscópio estéreo. Cruze individualmente cada macho selecionado para uma fêmea balanceadora a partir de uma linha apropriada para o alelo alvo.
Quando as larvas F2 eclodirem, escolha o pai F1 de cada cruzamento. Extraia o DNA genômico esmagando cada mosca por 10 a 15 segundos com uma ponta de pipeta contendo 50 microlitros de tampão de compressão sem dispensar o tampão. Em seguida, dispense o tampão restante no tubo e misture bem.
Incube a 37 graus Celsius por 20 a 30 minutos. Após a incubação, coloque os tubos em um bloco de calor a 95 graus Celsius por 1 a 2 minutos para inativar a proteinase K. Depois de girar por 5 minutos a 10.000 vezes g, armazene a preparação a 4 graus Celsius para posterior análise de PCR.
Realize triagens baseadas em PCR em três etapas usando primers para frente 1 e para trás 1 para rastrear a existência da inserção ou substituição. Realize PCR usando primers forward 2 e reverse 2 para verificar a inserção ou substituição de três regiões principais. Execute a PCR usando os primers M13F e o reverso 3 para verificar as extremidades no HDR.
- Mantenha as linhas de mosca com o HDR de fim confirmado e estabeleça estoques de equilíbrio da geração F2. Cruze as moscas balanceadoras novamente para remover quaisquer mutações não intencionais em outros cromossomos.