0 visualizações • 3:08 min. • April 30th, 2023
- Para imobilizar moscas para incorporação de parafina, empurre cuidadosamente a Drosophila anestesiada através da abertura de uma coleira de mosca para que suas cabeças fiquem uniformemente posicionadas na parte superior do dispositivo enquanto ainda estão presas ao resto do corpo. Para fixação do tecido, coloque os colares na solução de Carnoy. Carnoy's é um agente de fixação desnaturante que consiste em etanol, clorofórmio e ácido acético.
Para preparar a amostra para infiltração de parafina, desidrate o tecido transferindo o colar através de concentrações graduadas de etanol. Em seguida, transfira o colar para benzoato de metila, um solvente orgânico. Em seguida, coloque-o em uma solução de benozoato de metila e parafina derretida enquanto aquecido para garantir que a parafina permaneça derretida. Prossiga para uma série elaborada de etapas de lavagem apenas com parafina pré-aquecida para remover o benzoato de metila.
Em seguida, coloque rapidamente o colar em um molde e despeje a parafina derretida para cobri-lo completamente. Depois que a parafina endurecer, remova o bloco do molde e use uma lâmina de barbear para aparar o excesso de parafina. Quebre o colarinho deixando a fileira de cabeças embutidas no bloco de parafina. No protocolo de exemplo, veremos o procedimento demonstrado para a análise de fenótipos neurodegenerativos.
- Para começar, primeiro, use uma pinça para enfiar as moscas do sujeito pelo pescoço nas golas. Alinhe todas as cabeças na mesma orientação e certifique-se de que não ocorram danos na cabeça ou nos olhos. Inclua moscas senoidais oculares sem olhos em posições conhecidas aleatórias para que a ordem das moscas possa ser facilmente identificada nas seções. Além disso, se a cepa de mosca de interesse tiver olhos claros ou brancos, enfie moscas de olhos vermelhos em intervalos ao longo da faixa para garantir que haja pigmento suficiente para manchar a lâmina.
Registre a ordem das moscas junto com o número do colarinho, se mais de um for usado. Assim que um colar estiver pronto, coloque-o na solução de Carnoy por 3,5 a 4 horas. Realize uma série de lavagens com etanol, benzoato de metila e parafina para preparar o tecido da mosca para incorporação. Em seguida, coloque os colares em uma bandeja de cubos de gelo de borracha, um por seção.
Despeje delicadamente a parafina derretida sobre os colares evitando bolhas de ar e deixe endurecer durante a noite. Remova os blocos de parafina que contêm os colares da bandeja. Separe o bloco de parafina do colar usando uma lâmina de barbear, quebrando suavemente o colar. Os corpos permanecerão no colarinho enquanto as cabeças ficarão no bloco de parafina.