Preparação de filé larval: um método para visualizar neurônios sensoriais intactos e células epidérmicas associadas

- Para orientar uma larva para a dissecção do filé, coloque-a em um prato revestido de silicone contendo solução salina fria e identifique seus lados dorsal e ventral. Os tubos traqueais que correm ao longo de seu comprimento marcam o lado dorsal, enquanto os cintos denticulares abdominais identificam o lado ventral.

Em seguida, com o lado ventral para cima, estique suavemente a larva e prenda cada extremidade no fundo do prato. Esta posição manterá intactos os aglomerados dorsais de neurônios multidendríticos sensoriais e as células epidérmicas associadas à medida que a dissecção prossegue.

Use uma tesoura de dissecação para cortar ao longo da linha média ventral da larva. Prenda a cutícula na placa para achatar a preparação e remova as estruturas internas para revelar o tecido muscular subjacente. Em seguida, remova cuidadosamente o músculo apropriado para expor a epiderme e obter acesso a neurônios previamente obscurecidos, preservando sua morfologia dendrítica.

No protocolo de exemplo, veremos uma demonstração detalhada da preparação do filé larval e remoção muscular para visualizar neurônios sensoriais e células epidérmicas.

- Para começar, adicione solução salina fria suficiente a um prato de elastômero de silicone para cobrir a superfície inferior. Adicione a larva do sujeito ao prato e coloque-a sob o microscópio estéreo, garantindo o posicionamento adequado da luz. Posicione a larva com o lado ventral para cima, que pode ser identificado pelas correias denticulares abdominais.

Estique a larva na direção ântero-posterior e, usando alfinetes de insetos, prenda a cabeça e a cauda no fundo do prato. Com uma tesoura de dissecação fina, corte ao longo da linha média ventral da larva de uma ponta à outra. Abra a larva e prenda o tecido da cutícula nos quatro cantos para que fique plano.

Usando uma pinça, remova os órgãos internos, incluindo o SNC, intestino e traqueia. Ajuste os pinos de insetos para que o filé fique esticado, mas não esticado ao máximo.

Localize a linha média dorsal da larva, onde o tecido muscular está ausente e, em seguida, posicione uma ponta de fórceps no interior desse limite. Deslize o pino entre o músculo e a epiderme, tomando cuidado para minimizar o contato com a epiderme.

- Para minimizar os danos à epiderme, disseque com as pontas mais planas possíveis. E tente dissecar em solução salina contendo cálcio. Isso poderia ajudar a criar espaço entre o músculo e a epiderme.

- Em seguida, puxe a pinça para cima para quebrar a fixação do músculo à parede do corpo em um ponto de ancoragem. Repita esse processo para os demais segmentos musculares de interesse.

Reajuste os currais de insetos para esticar ao máximo o filé larval em todas as direções.