JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 vistas • 4:20 min • April 30th, 2023
- A glândula linfática larval de Drosophila melanogaster é responsável pela produção de hemócitos, ou células sanguíneas, que circulam na hemolinfa larval. Para identificar a glândula linfática, primeiro encontre o vaso dorsal, ou coração, que bombeia a hemolinfa por todo o corpo. Siga o vaso dorsal em direção à cabeça até encontrar o cérebro. A glândula linfática é uma pequena estrutura multilobada próxima ao cérebro, flanqueando o vaso dorsal.
Para encontrar o lobo primário, identifique o maior lobo da glândula. Este lobo contém três zonas, definidas por diferentes estágios de desenvolvimento de hemócitos. A zona medular mais próxima do vaso dorsal contém hemócitos imaturos, enquanto a zona cortical contém hemócitos maduros. Na extremidade posterior do lobo primário, você pode encontrar o centro de sinalização posterior, composto por hemócitos especializados. Os lobos secundário e terciário são menores e não possuem zonas definidas.
Para dissecar a glândula linfática, você precisará de um microscópio de dissecação, duas pinças para manipular as larvas e uma solução salina tamponada.
Neste exemplo, vamos dissecar os gânglios linfáticos para uso em imuno-histoquímica.
- Para iniciar a dissecção das glândulas linfáticas, adicione 1 mililitro de 1x PBS a 1 poço de uma placa de 24 poços para cada configuração experimental a ser dissecada. Em seguida, usando uma pipeta de transferência descartável, adicione 1 gota de PBST a 0,1% em cada poço. Coloque o prato sobre o gelo. Coloque uma almofada de dissecação limpa em uma base de estereomicroscópio iluminada. Use uma pipeta de transferência descartável para colocar uma gota de 0.01% de PBST na almofada.
Transfira uma larva para a gota PBST para dissecação. Segure a lava com um par de pinças, com o lado dorsal para cima, aproximadamente 1/4 de comprimento da extremidade posterior. Com o segundo par de pinças, pegue a cutícula imediatamente anterior ao primeiro par e puxe suavemente a cutícula larval em direção à anterior, até que os ganchos da boca fiquem expostos.
Solte a cutícula e use as duas pinças para dividir a larva. Remova a extremidade posterior da gota de PBST e descarte. Prenda a cutícula para estabilidade e, em seguida, use o segundo par de pinças para agarrar os ganchos da boca expostos e puxe-os com cuidado. Isso separará a cutícula das estruturas internas.
Segurando os ganchos da boca, remova cuidadosamente as estruturas indesejadas, como as glândulas salivares, o corpo gordo e o intestino. Pegue suavemente o complexo de tecido dissecado pelos ganchos da boca e transfira-o para um poço da placa no gelo. Repita a dissecção com quantas larvas desejar, mas não exceda um tempo de dissecção de 30 minutos antes de prosseguir para a etapa de fixação.
Para iniciar a montagem do tecido, coloque uma gota do tampão de montagem em uma lâmina de vidro. Usando os ganchos da boca como alça, transfira a glândula linfática para a gota tampão. Espace os tecidos uniformemente, espalhando o tampão de montagem no processo.
Deslize cuidadosamente uma pinça da pinça sob o vaso dorsal, puxando suavemente em direção à periferia do tampão de montagem para extrair e achatar a glândula linfática. Com um movimento de serra, corte o vaso dorsal entre a glândula linfática e o cérebro. Mova o resto dos tecidos para longe da glândula linfática para a borda mais externa do tampão.
Pegue uma lamínula limpa e abaixe-a cuidadosamente no amortecedor de montagem. As lâminas agora estão prontas para aquisição de imagens ou podem ser armazenadas a 4 graus Celsius até que sejam necessárias.