drosófila Dissecção do cérebro adulto: um método em neurobiologia de moscas

- Realize a dissecção em um prato com uma solução tampão e sob iluminação uniforme. Transfira uma mosca, com o lado ventral para cima, para o prato e mantenha a preparação submersa durante todo o procedimento. Enquanto segura a base da tromba, puxe suavemente a cabeça da mosca para longe do corpo para separar as duas. O cérebro está localizado na parte de trás, ou lado caudal, da cabeça da mosca. Portanto, segure as partes frontais ou rostrais da cutícula durante a dissecção para evitar danos ao órgão.

Para isolar o cérebro, segure a borda medial de um olho e segure e puxe a tromba na direção oposta para criar uma abertura na cápsula da cabeça. Enquanto segura a cutícula nesse olho, segure a borda medial da cutícula do outro olho e puxe lentamente a cápsula da cabeça para revelar o cérebro. Se necessário, continue a limpar a cutícula residual, os sacos de ar anexados ou a traqueia. Preparações de alta qualidade preservarão estruturas como os lobos ópticos, o cérebro central e o SOG. No protocolo de exemplo, veremos uma demonstração detalhada de uma dissecção cerebral adulta de Drosophila usada para estudar os corpos dos cogumelos.

- Para preparar a dissecação, coloque as moscas anestesiadas de interesse em uma almofada de metal fria ou em uma placa de Petri sobre o gelo. Como alternativa, use uma almofada de mosca que emita dióxido de carbono. Em seguida, coloque uma pequena quantidade de PTN no centro da placa de dissecação para criar uma bolha de PTN. Em seguida, sob um estereomicroscópio, preencha o campo de visão com a bolha PTN sob iluminação uniforme. Agora, manipule as moscas para que fiquem de barriga para cima e transfira uma pelo abdômen para o PTN. Mergulhe completamente o animal no PTN e realize toda a dissecção submersa no PTN. Com um segundo par de pinças, segure a tromba e puxe a cabeça para fora do corpo.

- Ocasionalmente, a tromba será removida, mas a cabeça permanecerá presa ao corpo. Se isso ocorrer, agarre a borda medial de uma retina e aplique força lateral para remover a cabeça.

- Descarte o abdômen e o tórax. É fundamental manter a cabeça no PTN durante esta etapa. As conexões do cérebro central com o VNC claramente não podem ser analisadas usando este método. Em seguida, segure a borda medial da retina esquerda na borda do orifício central na cutícula e puxe lentamente as pinças diretamente separadas uma da outra para evitar o rompimento do lobo óptico, que é a estrutura opaca coberta por uma traqueia branca e fibrosa. À medida que a retina se dissocia, haverá uma ligeira diminuição da tensão.

- Para evitar que o cérebro lacrimeje, é extremamente importante agarrar a borda medial de cada olho e separar muito lentamente a pinça. Mover-se muito rapidamente pode resultar em morfologia cerebral alterada ou danos ao tecido cerebral.

- Como mostrado aqui, segure a cutícula com cada par de pinças e puxe-as muito lentamente em direções opostas. Se feito corretamente, a cutícula deve se separar do tecido cerebral, deixando o cérebro intacto. Pinças muito afiadas são necessárias para esta etapa. Em seguida, remova cuidadosamente a cutícula ao redor, peça por peça. Ao remover a cutícula teimosamente presa, pode ajudar a proteger o cérebro, segurando o VNC restante para evitar esmagar o cérebro. Finalmente, use uma pipeta P200 para transferir os cérebros dissecados para um poço de uma placa cheia de PTN para fixação e imunocoloração.