Processamento de pernas de insetos para microscopia de fluorescência: um método para preservar estruturas neuromusculares para imagens

- Para começar, mergulhe os insetos anestesiados em solução de etanol a 70% para reduzir a hidrofobicidade da cutícula. Em seguida, lave e permeabilize o tecido com solução salina tamponada com fosfato contendo um detergente por pelo menos 30 minutos para permitir a penetração do tecido durante a fixação.

Em seguida, remova a cabeça e o abdômen do tórax. Use uma pinça para aplicar uma leve pressão na junção coxa-tórax e retire a perna. Coloque cuidadosamente as pernas em solução gelada de paraformaldeído a 4% durante a noite para permitir que ela penetre no tecido. O paraformaldeído fixa os tecidos por meio da reticulação de proteínas.

Em seguida, remova a solução de fixação e lave o tecido várias vezes com solução salina tamponada com fosfato contendo detergente. Antes de montar, coloque as pernas em tampão de montagem puro ou ligeiramente diluído por pelo menos um dia para fornecer tempo suficiente para que o tampão entre no tecido.

Por fim, monte as pernas em uma gota de meio de montagem. Use um espaçador entre a lâmina do microscópio e a lamínula para evitar danos à amostra e prenda o suporte com esmalte.

No exemplo a seguir, veremos a dissecação, fixação e montagem das pernas de Drosophila melanogaster.

- Comece preenchendo o número apropriado de poços em uma placa de vidro multipoços com etanol a 70%. Use um pincel para adicionar 15 a 20 moscas anestesiadas com dióxido de carbono de qualquer idade ou sexo a cada poço e passe suavemente as moscas no etanol até que estejam totalmente submersas.

Após não mais de um minuto, enxágue as moscas três vezes com solução de detergente surfactante não iônico a 0,3% em solução salina tamponada com fosfato por pelo menos 10 minutos por lavagem. Após a última lavagem, use uma pinça para remover a cabeça e o abdômen de cada mosca sem danificar o segmento torácico ou as pernas, e use a ponta de um par de pinças finas para aplicar pressão suave, mas firme, na junção coxa-tórax para separar uma perna do segmento torácico.

Coloque as pernas em um poço de uma nova placa multipoços, contendo paraformaldeído a 4% recém-preparado no gelo, para uma incubação noturna a 4 graus Celsius.

- É importante empurrar as pernas suavemente para dentro do tampão de fixação sem deixá-las flutuar para obter pernas bem fixadas.

- No dia seguinte, lave as pernas cinco vezes em solução fresca de detergente surfactante não iônico a 0,3% por 20 minutos por lavagem. Após a última lavagem, substitua o detergente por meio de montagem e mantenha as pernas no meio de montagem por pelo menos 24 horas.

No dia seguinte, adicione aproximadamente 20 microlitros de glicerol a 70% ao lado da extremidade revestida da lâmina do microscópio de vidro e cubra o glicerol com uma lamínula de 22 por 22 milímetros. Em seguida, adicione cerca de 10 microlitros de linha de meio de montagem à direita da lamínula e aplique uma segunda linha de 30 microlitros de meio de montagem à direita da linha de 10 microlitros.

Usando uma pinça fina, transfira uma perna da placa multipoços em uma gota de meio para a tira de 10 microlitros do meio de montagem em uma orientação externa para cima ou para baixo. Repita até que seis a oito pernas tenham sido montadas e alinhadas e coloque uma segunda lamínula sobre as pernas, de modo que a segunda lamínula fique ligeiramente apoiada na primeira lamínula. Em seguida, use esmalte em cada canto das lamínulas para prendê-las no lugar.