Ruptura da cutícula: um método para coletar hemolinfa de larvas de Drosophila

- Para começar, pipete uma gota de tampão em uma almofada de dissecação limpa. Em seguida, coloque uma larva viva seca na gota. A drosófila, como outros artrópodes, tem um sistema circulatório aberto no qual o coração bombeia hemolinfa pelo corpo, banhando os órgãos internos. Para liberar a hemolinfa, que é a combinação de sangue e fluido intersticial dos artrópodes, use uma pinça e abra a cutícula, a cobertura externa semirrígida das larvas.

Em seguida, descartar a carcaça e transferir a solução de hemolinfa da placa de dissecação para a solução tampão gelada em um tubo de microcentrífuga. Finalmente, use um hemocitômetro para contar o número de hemócitos, as células da hemolinfa, que foram coletadas. Neste protocolo, coletaremos hemolinfa de larvas de Drosophila melanogaster.

- Comece a coleta de hemolinfa adicionando 10 microlitros de 1x PBS a um tubo de microcentrífuga e colocando o tubo no gelo. Em seguida, coloque uma gota de 10 microlitros de 1x PBS em uma almofada de dissecação limpa. Selecione uma larva individual e seque-a colocando-a em um lenço de papel. Em seguida, transfira-o para a gota PBS na almofada de dissecação.

Usando uma pinça, rasgue e inverta suavemente a cutícula para liberar a hemolinfa e, em seguida, descarte a carcaça. Com uma pipeta, colete a hemolinfa da almofada de dissecação. Adicione a hemolinfa ao tubo de microcentrífuga PBS gelado e misture pipetando para cima e para baixo. Carregue 10 microlitros da amostra em uma câmara de hemocitômetro e faça uma leitura de concentração.