drosófila Dissecção do músculo de voo indireto (IFM) da pupa tardia: um método para coleta de tecido de alto rendimento

- Na mosca adulta, os músculos de vôo indireto, ou IFMs, são os maiores músculos da mosca, abrangendo todo o tórax. Os IFMs orquestram os movimentos característicos das asas de alta frequência em moscas de duas asas, incluindo Drosophila. Dois grupos opostos de fibras musculares compõem os IFMs.

Primeiro, os músculos longitudinais dorsais, ou DLMs, estão localizados ao longo do plano mediano do tórax acima do intestino e se estendem de anterior a posterior. Em segundo lugar, os músculos ventrais dorsais, ou DVMs, vão de cima para baixo do tórax e são flanqueados pelo TDT, ou músculo do salto. Ambos os grupos musculares estão ligados à cutícula.

Cerca de 48 horas após a formação do pupário, ou APF, os IFMs em maturação podem ser identificados visualmente com um microscópio de dissecção simples. No protocolo de exemplo, coletaremos IFMs de pupas com mais de 48 horas de APF para análise de alto rendimento.

- Para dissecção IFM após 48 horas APF, use um pincel levemente umedecido para transferir as pupas estagiadas para uma tira de fita adesiva dupla face montada em uma lâmina de microscópio. Oriente as pupas em uma linha, com o lado ventral voltado para baixo e anterior em direção à parte inferior da lâmina. Quando todas as pupas tiverem sido colocadas, use uma pinça para separar e abrir a primeira caixa de pupa acima dos espiráculos anteriores e deslize suavemente um par de pinças dorsalmente em direção à parte posterior, cortando a caixa de pupa à medida que a pinça se move.

Liberte a pupa da caixa aberta e transfira imediatamente a pupa para uma gota de PBS em uma segunda lâmina de microscópio. Quando todas as pupas estiverem liberadas, use uma tesoura fina para cortar o abdômen das pupas do tórax e empurre o abdômen para uma pilha separada. Quando todos os tórax tiverem sido removidos, use um pedaço de papel de seda para remover a maior parte do PBS e a pilha de abdômens.

Adicione uma gota de PBS fresco e resfriado aos tórax restantes antes de usar a tesoura para cortar a cabeça ao longo do eixo longitudinal do corpo em um único movimento para dividir o tórax ao meio. Quando todas as pupas tiverem sido dissecadas, use a pinça número cinco para selecionar uma das hemisseções e insira suavemente as pontas de uma pinça acima e abaixo do meio dos IFMs.

Segurando o primeiro par de pinças, use uma tesoura fina para cortar uma extremidade do IFM da cutícula e dos tendões antes de girar a pupa 180 graus para permitir que a outra extremidade do IFM seja cortada da cutícula e dos tendões. Use uma pinça para transferir o feixe IFM do tórax para a borda da bolha PBS usando a tensão da água para manter o feixe no lugar.

Em seguida, empurre a carcaça para o lado oposto da lâmina e disseque o resto dos IFMs da mesma maneira. Quando todos os IFMs tiverem sido coletados, use a pinça número cinco para remover qualquer músculo do salto ou fragmentos de cutícula que possam ter entrado nas amostras. Em seguida, use a tensão da água para capturar suavemente os IFMs dissecados entre um par de pinças e coloque os IFMs em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 250 microlitros de PBS resfriado.