JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 vistas • 2:56 min • April 30th, 2023
- Transfira C. elegans lavado em líquido para uma lâmina de vidro previamente revestida com polilisina, um composto que ajudará as cutículas dos vermes a aderirem à superfície do vidro. Pressione suavemente outra lâmina de vidro para baixo com uma borda pendendo sobre a corrediça inferior. Para imobilizar os vermes sem danos, comprima os animais evitando movimentos laterais. Em seguida, coloque as lâminas de vidro com minhocas imprensadas em um bloco de metal dentro de um recipiente de laboratório isolado cheio de um agente de congelamento, como nitrogênio líquido ou gelo seco.
O metal é um condutor de temperatura eficaz, garantindo que a superfície do bloco esteja fria o suficiente para congelar rapidamente as cutículas do verme em ambas as superfícies de vidro. Depois de congeladas, separe rapidamente as lâminas de vidro para separar ou abrir as cutículas do verme. Prossiga com a fixação e coloração do tecido, pois a ruptura da cutícula de baixa permeabilidade permite que fixadores químicos e anticorpos de coloração acessem os tecidos internos do verme. No protocolo a seguir, veremos uma demonstração detalhada da técnica de fissuração por congelamento e fixação tecidual.
- Primeiro, prepare um slide para consertar os vermes. Pipete 30 microlitros de poli-L-lisina em uma lâmina e, em seguida, coloque uma segunda lâmina na outra e esfregue-as para espalhar a solução uniformemente em ambas. Agora, separe as duas lâminas e deixe-as secar ao ar por 30 minutos.
Em seguida, coloque um bloco de metal plano em um recipiente cheio de nitrogênio líquido. Lave as placas com solução M9 e transfira cerca de 10 microlitros de M9 contendo os vermes. Como alternativa, escolha as minhocas e adicione M9 ao slide.
Depois que os vermes forem transferidos, solte suavemente uma lamínula transversalmente sobre eles, de modo que a lamínula fique saliente sobre uma borda. Em seguida, pressione suavemente a lamínula sem fazer movimentos laterais.
Agora, transfira imediatamente a lâmina para o bloco de metal em nitrogênio líquido e deixe congelar. Após cinco minutos, retire a lamínula usando a borda saliente. Faça isso rapidamente para obter a rachadura adequada da cutícula.
Em seguida, mergulhe a lâmina em um frasco de vidro Coplin cheio de metanol a menos 20 graus Celsius. Após cinco minutos, transfira a lâmina para um frasco de vidro Coplin cheio de acetona por mais cinco minutos na mesma temperatura. As lâminas podem ser coradas diretamente ou armazenadas a menos 20 graus Celsius.