C. elegans Extrusão de gônadas: uma técnica de dissecção rápida

- Em um tubo contendo tampão M9, colete até 150 vermes hermafroditas no estágio desejado de desenvolvimento. Remova as bactérias dos vermes lavando com tampão M9 e centrifugando a amostra.

View o tubo sob um microscópio de dissecação ao remover o sobrenadante para evitar a perda de amostra. Transfira as minhocas para um prato de vidro com um volume mínimo de tampão M9. Adicione levamisol para anestesiar os vermes.

Localize a cabeça do verme e a faringe, ou intestino anterior, que contém duas estruturas em forma de bulbo. Usei duas agulhas para cortar o verme atrás da faringe. Certifique-se de concluir a dissecção rapidamente para evitar afetar o tecido.

Uma vez que a cutícula é rompida, os dois braços da gônada são extrudados ou empurrados para fora do corpo devido à pressão interna do verme.

Neste exemplo, vamos dissecar gônadas de vermes adultos para análise de imunofluorescência.

- Escolha de 100 a 150 minhocas no estágio de desenvolvimento desejado e colete-as em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 100 microlitros de tampão M9. Em seguida, encha o tubo da microcentrífuga com mais 900 microlitros de tampão M9 e centrifugue-o a 1.000 vezes g por 1 minuto em temperatura ambiente.

Sob um microscópio de dissecação, remova suavemente 900 microlitros do tampão M9. Em seguida, repita a lavagem mais duas vezes para remover a maioria das bactérias aderidas.

Em seguida, usando uma ponta de micropipeta de 200 microlitros com um orifício alargado, transfira os vermes em 100 microlitros de tampão M9 para um prato de relógio de vidro de fundo plano. Em seguida, adicione 1 a 3 microlitros de levamisol 0,1 molar ao prato e agite-o suavemente. Agora, prenda duas agulhas de calibre 25 a duas seringas para fazer uma ferramenta de dissecação para cada mão.

Sob um microscópio de dissecação, posicione cada agulha sob e sobre cada verme e faça um corte fino em cada verme perto do segundo bulbo faríngeo usando um movimento semelhante a uma tesoura. Corte todos os animais pelo menos uma vez em cinco minutos para que o levamisol permaneça eficaz.

- É muito importante que a dissecação dos animais no prato seja concluída em menos de cinco minutos.

- Caso uma gônada extrudada não esteja visível, basta pular esse animal. Gônadas extrudadas adequadas são visíveis aqui.