0 visualizações • 2:44 min. • April 30th, 2023
- Para análise de PCR de verme único, permita que um verme hermafrodita se autofecunde e ponha ovos que produzirão descendentes geneticamente idênticos e, portanto, preservem uma cópia da cepa modificada. Em seguida, transfira o pai para um tubo contendo tampão de lise de vermes.
Congele o tubo a 80 graus Celsius negativos para abrir a cutícula ou a camada externa. Aqueça a amostra a mais 60 graus Celsius para lisar as células vermes liberando as proteínas intracelulares junto com o DNA genômico da célula. Nessa temperatura, a proteinase K dentro do tampão degrada as proteínas, particularmente as nucleases que, de outra forma, destruiriam o DNA genômico.
Em seguida, aumente a temperatura para 95 graus Celsius para inativar a enzima. Finalmente, adicione o lisado celular a um tubo com uma mistura mestre de PCR composta de tampão de reação, dNTPs, primers diretos e reversos para a região de interesse, taq polimerase e água, levando a reação a um volume final desejado. Para realizar a PCR, execute o programa termociclador apropriado que amplifica a região de DNA de interesse.
No exemplo a seguir, veremos um procedimento de PCR para rastrear eventos de edição CRISPR-Cas9 no DNA genômico de vermes F1 únicos.
- Após 1 a 2 dias de postura de ovos, use uma foto de minhoca para transferir os F1s para tampas de tubo de tira de PCR individuais contendo 7 microlitros de tampão de lise quente. Centrifugue os tubos de PCR na velocidade máxima e à temperatura ambiente durante um minuto para levar os animais ao fundo do tubo. Em seguida, congele os tubos a 80 graus Celsius negativos por uma hora.
Em seguida, lise minhocas congeladas em um termociclador usando o seguinte programa. Em seguida, configure uma mistura principal de PCR conforme mostrado nesta tabela.
Adicione 21 microlitros de mistura principal de PCR em tubos de PCR limpos. Em seguida, adicione 4 microlitros do tubo de lise do verme e misture bem pipetando.
Em seguida, execute o programa de PCR seguindo as diretrizes do fabricante.