PCR de verme único: um método para extrair e amplificar o DNA genômico

- Para análise de PCR de verme único, permita que um verme hermafrodita se autofecunde e ponha ovos que produzirão descendentes geneticamente idênticos e, portanto, preservem uma cópia da cepa modificada. Em seguida, transfira o pai para um tubo contendo tampão de lise de vermes.

Congele o tubo a 80 graus Celsius negativos para abrir a cutícula ou a camada externa. Aqueça a amostra a mais 60 graus Celsius para lisar as células vermes liberando as proteínas intracelulares junto com o DNA genômico da célula. Nessa temperatura, a proteinase K dentro do tampão degrada as proteínas, particularmente as nucleases que, de outra forma, destruiriam o DNA genômico.

Em seguida, aumente a temperatura para 95 graus Celsius para inativar a enzima. Finalmente, adicione o lisado celular a um tubo com uma mistura mestre de PCR composta de tampão de reação, dNTPs, primers diretos e reversos para a região de interesse, taq polimerase e água, levando a reação a um volume final desejado. Para realizar a PCR, execute o programa termociclador apropriado que amplifica a região de DNA de interesse.

No exemplo a seguir, veremos um procedimento de PCR para rastrear eventos de edição CRISPR-Cas9 no DNA genômic