Why does Nile Red emission shift to yellow-gold wavelengths?

Nile Red emission shifts to yellow-gold wavelengths when bound to neutral lipids like triacylglycerols in the hydrophobic core of lipid droplets, indicating low polarity environments.

How does isopropanol fixation enable lipid droplet visualization?

Isopropanol fixation permeabilizes the worm's cells, allowing Nile Red dye to access intracellular lipid droplets throughout the fixed animal for staining.

What quantitative measurement does green channel fluorescence provide?

Green channel fluorescence measures Nile Red's emission from neutral lipid environments, enabling quantification of lipid droplet abundance and distribution.

Why are replication requirements important for lipid staining?

Replication ensures consistent lipid visualization across samples, supporting reliable data generation for cross-functional target validation and assay development.

What statistical analysis is needed before implementing Nile Red staining?

Basic fluorescence intensity comparison and co-localization analysis are required to validate lipid droplet staining specificity and normalize across experimental conditions.

Coloração com vermelho do Nilo de C. elegans: um método para visualizar gotículas lipídicas em animais fixos

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologia

0 vistas • 3:34 min • April 30th, 2023

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- Ao visualizar gotículas lipídicas, as organelas de armazenamento intracelular para lipídios neutros, começam adicionando uma solução detergente, como uma contendo Triton X-100, à amostra. Isso permeabilizará as células do verme. Em seguida, fixe a amostra na concentração apropriada de isopropanol, por exemplo, 40%.

Em seguida, adicione Nile Red à amostra e proteja-a da luz, pois o corante é sensível à luz. A fixação permite que o corante acesse gotículas lipídicas em todo o animal. O vermelho do Nilo é um corante lipofílico cujo espectro de emissão de fluorescência depende da polaridade do ambiente lipídico local.

Quando exposto a lipídios polares, como fosfolipídios, o espectro de emissão do Vermelho do Nilo está nos comprimentos de onda vermelhos mais altos. Quando exposto a lipídios neutros, como triacilgliceróis e ésteres de esteróis no núcleo neutro das gotículas lipídicas, o espectro de emissão do Vermelho do Nilo muda para os comprimentos de onda amarelo-ouro mais baixos.

Portanto, use o canal verde de um microscópio fluorescente, que coletará as emissões de comprimento de onda amarelo-ouro, para visualizar a coloração de gotículas lipídicas em todo o animal. No protocolo de exemplo, veremos um procedimento de coloração com Vermelho do Nilo e imagens de gotículas lipídicas em amostras fixas.

- Para realizar a coloração lipídica do Vermelho do Nilo, os vermes da placa em meio de crescimento de nematóides, ou NGM, semeados com E. coli OP50 de log tardio, e cultive os vermes a 20 graus Celsius até o estágio inicial de L4. Lave as minhocas com 1 mililitro de solução PBST e transfira a suspensão sem-fim para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Centrifugue os vermes a 560 vezes a gravidade por um minuto, depois remova o sobrenadante e repita a lavagem PBST até que a E. coli seja removida da suspensão. Em seguida, ao pellet de minhoca, adicione 100 microlitros de isopropanol a 40%, ou 60% para coloração ORO, e incube a amostra em temperatura ambiente por três minutos.

- A adição de isopropanol é crucial para a permeabilização adequada dos vermes antes da coloração.

- Centrifugue os vermes a 560 vezes a gravidade por um minuto e remova o sobrenadante sem interromper o pellet de minhoca.

- É importante minimizar a exposição à luz durante as etapas de centrifugação.

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Última atualização: 1 agosto 2026

Coloração com vermelho do Nilo de C. elegans: um método para visualizar gotículas lipídicas em animais fixos

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