Coloração com vermelho do Nilo de C. elegans: um método para visualizar gotículas lipídicas em animais fixos
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 vistas • 3:34 min • April 30th, 2023
- Ao visualizar gotículas lipídicas, as organelas de armazenamento intracelular para lipídios neutros, começam adicionando uma solução detergente, como uma contendo Triton X-100, à amostra. Isso permeabilizará as células do verme. Em seguida, fixe a amostra na concentração apropriada de isopropanol, por exemplo, 40%.
Em seguida, adicione Nile Red à amostra e proteja-a da luz, pois o corante é sensível à luz. A fixação permite que o corante acesse gotículas lipídicas em todo o animal. O vermelho do Nilo é um corante lipofílico cujo espectro de emissão de fluorescência depende da polaridade do ambiente lipídico local.
Quando exposto a lipídios polares, como fosfolipídios, o espectro de emissão do Vermelho do Nilo está nos comprimentos de onda vermelhos mais altos. Quando exposto a lipídios neutros, como triacilgliceróis e ésteres de esteróis no núcleo neutro das gotículas lipídicas, o espectro de emissão do Vermelho do Nilo muda para os comprimentos de onda amarelo-ouro mais baixos.
Portanto, use o canal verde de um microscópio fluorescente, que coletará as emissões de comprimento de onda amarelo-ouro, para visualizar a coloração de gotículas lipídicas em todo o animal. No protocolo de exemplo, veremos um procedimento de coloração com Vermelho do Nilo e imagens de gotículas lipídicas em amostras fixas.
- Para realizar a coloração lipídica do Vermelho do Nilo, os vermes da placa em meio de crescimento de nematóides, ou NGM, semeados com E. coli OP50 de log tardio, e cultive os vermes a 20 graus Celsius até o estágio inicial de L4. Lave as minhocas com 1 mililitro de solução PBST e transfira a suspensão sem-fim para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Centrifugue os vermes a 560 vezes a gravidade por um minuto, depois remova o sobrenadante e repita a lavagem PBST até que a E. coli seja removida da suspensão. Em seguida, ao pellet de minhoca, adicione 100 microlitros de isopropanol a 40%, ou 60% para coloração ORO, e incube a amostra em temperatura ambiente por três minutos.
- A adição de isopropanol é crucial para a permeabilização adequada dos vermes antes da coloração.
- Centrifugue os vermes a 560 vezes a gravidade por um minuto e remova o sobrenadante sem interromper o pellet de minhoca.
- É importante minimizar a exposição à luz durante as etapas de centrifugação.
- Agora, enquanto estiver no escuro, adicione 600 microlitros de solução de trabalho NR previamente preparada a cada amostra. Inverta os tubos três vezes e misture totalmente os vermes e a solução. Em seguida, incubar a amostra no escuro à temperatura ambiente durante duas horas.
Após a incubação, centrifugue os vermes e remova o sobrenadante. Em seguida, adicione 600 microlitros de PBST e incube as amostras no escuro por 30 minutos para remover o excesso de mancha NR. Depois de girar as amostras novamente como antes, remova todos, exceto aproximadamente 50 microlitros de sobrenadante.
Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para visualizar gotículas lipídicas em nematodos utilizando coloração com Red Nile. O método envolve a permeabilização das células, a fixação das amostras e o uso de microscopia de fluorescência para observar as gotículas lipídicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Bioquímica
Contexto
- As gotículas lipídicas são organelas de armazenamento intracelulares para lipídios neutros.
- O Nile Red é um corante lipofílico utilizado para coloração de lipídios.
- A fluorescência do corante varia conforme o ambiente lipídico.
- A fixação e a permeabilização adequadas são cruciais para uma coloração eficaz.
Objetivo do Estudo
- Visualizar gotículas lipídicas em nematoides.
- Demonstrar o uso do vermelho de Nile para coloração de lipídios.
- Fornecer um protocolo detalhado para pesquisadores.
Métodos Utilizados
- Preparação de nematoides em meio de crescimento.
- Lavagem e centrifugação das amostras de vermes.
- Fixação com isopropanol para permeabilização.
- Coloração com vermelho de Nile e subsequente obtenção de imagens.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de gotículas lipídicas utilizando microscopia de fluorescência.
- Demonstração das alterações no espectro de emissão do Nile Red com base no tipo de lipídio.
- Efetividade do protocolo confirmada por meio de resultados reprodutíveis.
- Importância de minimizar a exposição à luz durante o procedimento destacada.
Conclusões
- O vermelho de Nilo é uma ferramenta eficaz para a visualização de gotículas lipídicas.
- A preparação adequada da amostra é essencial para resultados precisos.
- Este protocolo pode auxiliar em estudos posteriores do metabolismo lipídico.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A coloração com vermelho de Nilo permite a visualização de gotículas lipídicas em organismos modelo, auxiliando na validação de alvos na pesquisa de doenças metabólicas. O método fornece dados quantitativos sobre a distribuição de lipídios que ajudam na redução de riscos mecanicistas de hipóteses terapêuticas. Esta abordagem aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta, associando alterações fenotípicas nos lipídios à modulação de vias metabólicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas por meio da visualização do acúmulo de lipídios neutros nos núcleos das gotículas lipídicas.
- Valor Operacional: Permite a desconsideração de riscos biológicos por meio da observação direta de organelas de armazenamento de lipídios em amostras fixadas.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao correlacionar fenótipos de gotículas lipídicas com intervenções genéticas ou compostos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos moduladores de lipídios em etapas subsequentes.
- Saída Quantitativa: Gera medições de abundância lipídica baseadas em fluorescência, permitindo a padronização do ensaio.
- Escalabilidade: Facilita a visualização reprodutível de lipídios em múltiplas amostras para reutilização da plataforma.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Relaciona fenótipos de gotículas lipídicas a modelos de doenças metabólicas em C. elegans.
- Continuidade Translacional: Conecta observações de descoberta à validação pré-clínica do metabolismo lipídico.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta critérios de avanço com base em alterações na distribuição de lipídios em sistemas relevantes para doenças.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer leituras fenotípicas de lipídios que informam as etapas de validação de alvos e identificação de compostos promissores.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias do metabolismo de lipídios por meio da visualização direta de gotículas lipídicas.
- Triagem: Permite o desenvolvimento de ensaios para compostos que afetam o armazenamento de lipídios com fixação e coloração padronizadas.
- Análises: Fornece leituras quantitativas de fluorescência no canal verde para comparar a abundância de lipídios entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona alterações nas gotículas lipídicas à continuidade pré-clínica por meio de mecanismos conservados do metabolismo de lipídios.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de visualização de lipídios aplicável a diversas linhagens de nematoides e condições experimentais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista em fenótipos de armazenamento de lipídios.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos com amostras fixadas e manuseio controlado de corantes.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de avanço ou interrupção ao fornecer âncoras fenotípicas baseadas em lipídios para alvos metabólicos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base na eficácia da modulação de gotículas lipídicas.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência e biologia de lipídios para interpretação espectral precisa.
- Necessita de instrumentação capaz de detectar emissão no canal verde para visualizar lipídios neutros corados com Nile Red.
- Exige padronização entre equipes nos procedimentos de fixação, permeabilização e controles de exposição à luz.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes sistemas modelo ou tipos de lipídios.
- Inclui limitações práticas, como a sensibilidade do corante à luz e a dependência da fixação adequada da amostra para acessibilidade.
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Última atualização: 22 agosto 2026