Plaqueamento de RNAi para alimentação de C. elegans: uma técnica para induzir a expressão de dsRNA alvo em E. coli

- Em C. elegans, o RNAi pode ser induzido alimentando vermes com bactérias que expressam RNA de fita dupla ou dsRNA de um plasmídeo de DNA recombinante.

Para começar, cultive E. coli HT115 resistente à tetraciclina transfectada com plasmídeo L4440 durante a noite em placas de ágar LB seletivas contendo tetraciclina e ampicilina, ou seu análogo funcional carbenicilina. Além do DNA alvo, o plasmídeo contém um gene para resistência à ampicilina. Apenas colônias de bactérias que herdam o plasmídeo podem crescer na presença desses antibióticos.

Em seguida, colha colônias de bactérias e expanda-as em meio LB líquido até a concentração desejada. Para induzir a expressão de dsRNA, transfira a solução bacteriana para placas de ágar de meio de crescimento de nematóides preparado, ou NGM, contendo IPTG.

Nesse sistema de expressão, o IPTG mimetiza a lactose para inativar o repressor lac, permitindo a expressão da RNA polimerase T7. No plasmídeo, a expressão do DNA alvo é regulada por dois promotores T7 convergentes. Consequentemente, as sequências de sentido e anti-sentido são transcritas levando à expressão do dsRNA.

Finalmente, o verme usa as informações de sequência do dsRNA ingerido para r