Ensaio de olfatômetro de quatro vias: um método para avaliar as respostas de odorantes em Drosophila

- Um olfatômetro de quatro vias é uma câmara fechada com portas unidirecionais em cada canto, através das quais pode fornecer até quatro odores, criando quadrantes com perfis de odor distintos. Comece um experimento transferindo moscas acordadas para a câmara. Evite anestesia, pois isso pode afetar seu comportamento durante o experimento.

Exponha as moscas ao ar puro e observe seus movimentos para garantir que nenhum odor esteja contaminando o olfatômetro e afetando o comportamento da mosca. Em seguida, prepare os odores de teste em frascos separados e conecte-os à câmara principal através das portas unidirecionais. Exponha as moscas aos odores por um período pré-definido, removendo o estímulo após o término do teste.

As moscas tendem a evitar quadrantes com odores repelentes enquanto se movem e se instalam em quadrantes com odores atraentes. Meça as respostas comportamentais das moscas rastreando suas posições ao longo do tempo enquanto exploram o olfatômetro.

No protocolo a seguir, usaremos um olfatômetro de quatro quadrantes com um sistema de entrega de ar para analisar o comportamento da mosca em resposta ao propionato de etila, um odor repelente, e vinagre de maçã, que é atraente.

- Com pelo menos cinco minutos de antecedência, ligue o controlador de temperatura e ajuste-o para 25 graus Celsius. Em seguida, conecte as câmaras de odor à arena por meio de um tubo de plástico. Verifique a taxa de fluxo de ar em cada quadrante da arena usando um medidor de vazão eletrônico. Certifique-se de que o controle e os fluxos de odor e ar estejam funcionando a 100 mililitros por minuto.

- As moscas são muito sensíveis ao fluxo de ar e é fundamental que o fluxo de ar para cada quadrante seja verificado antes de cada experimento.

- Agora, limpe a arena e as placas de vidro usando etanol 70%. Limpe todas as peças duas a três vezes e deixe-as secar completamente ao ar antes de prosseguir. Em seguida, prenda as placas de vidro na arena. Em seguida, transfira as moscas para a arena sem anestesia. Usando a gravidade, deixe-os entrar pelo orifício em uma das placas de vidro e, em seguida, cubra o orifício com uma malha circular.

Agora, coloque a arena carregada de moscas na câmara à prova de luz. Em seguida, conecte os quatro fluxos de ar de controle a cada canto da arena. Feche a porta da câmara e deixe as moscas se aclimatarem ao novo ambiente por 10 a 15 minutos.

Após o período de aclimatação, execute um experimento de controle de 5 a 10 minutos no qual as moscas são expostas a quatro correntes de ar de controle. É essencial agora analisar os dados imediatamente. Se as moscas não forem distribuídas uniformemente na arena, a arena deve ser reiniciada.

- É fundamental testar o comportamento das moscas de controle apenas para limpar o ar. Isso verificará rapidamente se todas as condições de fundo estão normais. Vazamento de luz, desequilíbrio de temperatura, arena inclinada ou contaminação por odor podem causar problemas.

- Se necessário, descarte as moscas e limpe a arena novamente. Se houver suspeita de contaminação por odor, substitua toda a tubulação. Continue repetindo o teste de controle com novas coortes até que os animais não mostrem preferência por nenhum dos quatro quadrantes. Em seguida, conecte a câmara de odor de teste à configuração usando uma válvula de três vias ou reconecte a tubulação e execute um experimento de teste por 5 a 10 minutos. Para gravações experimentais mais longas, pare e reinicie rapidamente o programa de rastreamento a cada 20 minutos, ou os arquivos de dados ficarão muito grandes.

Entre os testes, descarte as moscas, limpe a arena e as placas de vidro com etanol 70% e substitua os tubos conectores. Mantenha o fluxo de ar seco para lavar continuamente o sistema. Para maior eficiência, é bom ter duas arenas para que a limpeza possa ser feita durante as corridas.

- Se vários experimentos forem realizados no mesmo dia, preste muito cuidado para garantir que nenhum odor seja deixado no sistema de uma execução anterior. Isso normalmente não é um problema com baixas concentrações de odorante ou com CO2. Mas para estímulos altamente concentrados, pode ser necessário um intervalo de até 24 horas entre as execuções do experimento.