JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 vistas • 4:28 min • April 30th, 2023
- Um labirinto em Y consiste em um conector em forma de Y com três frascos de mosca conectados a ele por tubos retos ou cônicos. As moscas se movem pelo labirinto em direção ao lado com o estímulo que preferem. Para iniciar o experimento, coloque um lenço de papel com a solução contendo os produtos químicos voláteis em cada frasco. Em seguida, conecte-os aos tubos cônicos. Os tubos cônicos limitam a capacidade das moscas de retornar ao centro do labirinto e retardam a difusão dos produtos químicos voláteis.
Em seguida, moscas famintas para desacelerá-las. Não use anestesia química, pois isso pode afetar o resultado do ensaio. Conecte rapidamente o frasco com as moscas resfriadas ao lado final do labirinto. Deixe as moscas explorarem o labirinto. Para reduzir qualquer preferência causada pela luz brilhante, execute esta etapa sob luz vermelha distante, que as moscas não veem. Finalmente, conte as moscas de cada lado do labirinto. Sua localização no labirinto indica sua preferência por esse cheiro químico volátil.
No protocolo de exemplo, veremos uma configuração do ensaio do labirinto em Y com Drosophila do tipo selvagem.
- Antes de realizar o ensaio na manhã seguinte, no final do dia, transfira coortes de 10 a 20 linhas experimentais para frascos de vidro com umidade fornecida por uma toalha molhada. As moscas devem ser testadas em 16 a 18 horas, ou podem morrer devido à dessecação ou fome. No dia seguinte, monte o labirinto em Y. Comece juntando o conector em forma de Y a dois frascos de vidro usando conectores de espuma com pontas de pipeta aparadas que formam os conduítes. Sua forma afilada torna essas passagens unidirecionais.
O terceiro ramo do "Y" é preso a um tubo de carregamento, feito a partir da grande parte de uma ponta de pipeta, e permite a passagem do frasco de carregamento até o ponto de escolha do labirinto. Além de cada túnel de afunilamento há um frasco de vidro, um dos quais deve ser carregado com um odorante. Carregue-os como bolus de 40 microlitros embebidos em quadrados de 28 milímetros de papel de seda. Qual dos dois contém o odor deve alternar aleatoriamente.
Para realizar o teste, primeiro resfrie as moscas no gelo brevemente, para que as moscas sejam desaceleradas. Isso deve estar sob luz vermelha distante de lâmpadas LED e a 25 graus Celsius. Solte suavemente a coorte de moscas no frasco de carregamento e carregue o labirinto em Y com as moscas de teste. Não use anestesia gasosa.
- É realmente fundamental transferir as moscas para o frasco de carregamento de forma rápida e suave. Na verdade, é o passo mais difícil deste experimento porque as moscas precisam acordar rapidamente antes da difusão de odores no labirinto em Y.
- As moscas devem explorar o labirinto por 24 horas, de modo que um número máximo de moscas se mova para um ou outro frasco de vidro. O número de moscas presentes nos diferentes tubos serve para calcular o índice olfativo. Métodos estatísticos padrão devem ser aplicados a esse valor, obtido a partir do comportamento de até 10 moscas.
Se as coortes de 10 moscas não estiverem fornecendo resultados consistentes, os ensaios podem ser executados com coortes de 20 moscas. Para limpar os componentes do labirinto, mergulhe-os, desmontados, em RBS 35 MD durante a noite. Em seguida, enxágue em água da torneira e um enxágue final em água DI antes de secar ao ar.