0 visualizações • 5:51 min. • April 30th, 2023
- Colete embriões vivos de Drosophila e remova seus córions não transparentes. Em seguida, em uma lamínula de vidro, aplique uma linha de cola de heptano, que é fita adesiva dissolvida em heptano líquido. Para poder manusear os embriões agora descorionados, alinhe cuidadosamente as amostras em uma fileira no adesivo.
Transfira a lamínula para uma câmara de desidratação para dessecar parcialmente os embriões. Isso evitará vazamento citoplasmático durante ou após as injeções. Em seguida, remova a lamínula e cubra os embriões com óleo de halocarbono para evitar mais desidratação e ainda permitir que o oxigênio se difunda nos embriões.
Para realizar a microinjeção, use um sistema de microinjeção em um microscópio compatível. Olhando através dos pedaços dos olhos, identifique os embriões e a agulha pré-carregada com solução injetável. Abra a agulha e certifique-se de que ela produza gotas de líquido consistentes e de tamanho adequado. Em seguida, traga a agulha para dentro do embrião e injete o volume apropriado. Retire a agulha e prossiga para a próxima, repetindo a injeção para os embriões restantes.
No protocolo de exemplo, veremos uma demonstração de microinjeção de embriões de Drosophila para estudos de imagem ao vivo da divisão celular.
- Antes de montar a lamínula, faça cola de heptano desenrolando fita adesiva dupla e colocando-a em uma garrafa de 100 mililitros. Adicione cerca de 50 mililitros de heptano, feche a garrafa e balance-a por vários dias.
Antes de preparar os embriões, faça uma câmara de desidratação na qual os embriões serão colocados antes da injeção. Para fazer isso, coloque uma parte de uma placa de 35 milímetros dentro de uma placa de Petri de 100 milímetros para fazer uma "mesa". Adicione a Drierita, que é sulfato de cálcio anidro, ao redor dela para que a altura da Drierita não seja maior que a "mesa" e cubra.
Para começar a preparar os embriões, primeiro colete-os da gaiola de postura, trocando o prato de suco de uva com fermento a cada hora. Os embriões devem ser fotografados cerca de duas horas após o início da coleta. Para preparar a lamínula, coloque-a em um lado de uma lâmina de microscópio e prenda os quatro cantos para baixo, para que ela não se mova.
Usando um aplicador com ponta de algodão, coloque uma camada de cola de heptano em uma linha na lamínula. A cola não deve ser viscosa e deve secar em alguns segundos. Se for muito grosso, adicione mais heptano.
Por fim, coloque um pedaço de fita adesiva dupla no slide ao lado da lamínula. Com um pincel umedecido, retire cuidadosamente os embriões do prato de suco de uva e coloque-os na fita adesiva dupla na lâmina.
Em seguida, use metade de uma pinça para rolar os embriões sobre a fita adesiva dupla até que o córion se abra. Pegue o embrião rolando-o suavemente sobre o córion, para que ele grude na pinça, e coloque-o sobre a cola de heptano na lamínula com o lado comprido do embrião paralelo ao lado comprido da lamínula.
Coloque de 10 a 20 embriões em uma fileira. Remova a lamínula e coloque-a na câmara de desidratação por três a oito minutos. O tempo depende da umidade local e da quantidade a ser injetada. Em seguida, coloque a lamínula em uma câmara de metal com graxa a vácuo. Finalmente, cubra os embriões com óleo de halocarbono para evitar mais desidratação. Os embriões estão agora prontos para injeção.
Primeiro, encontre os embriões sob uma objetiva de 16X. Afaste os embriões e encontre a agulha sem mover o plano focal. Centralize a agulha e mova-a para cima sem movê-la na direção X ou Y.
Para abrir a agulha, coloque a borda da lamínula no campo de view, mas não onde uma agulha estará, e abaixe a agulha para o mesmo plano focal. Com muito cuidado, mova a lamínula até que ela atinja a agulha e a abra suavemente. Mova a agulha para cima.
Agora traga os embriões à vista. Abaixe a agulha no óleo e certifique-se de obter boas gotas líquidas da agulha. Mova constantemente o embrião para a agulha, injete uma gota no embrião e, em seguida, afaste o embrião. Depois que todos os embriões foram injetados, eles estão prontos para observação em um microscópio confocal com objetiva de 60 ou 100X.