JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 vistas • 2:38 min • April 30th, 2023
- Para preparar larvas de Drosophila para um ensaio de sonda de calor, colete animais do estágio de desenvolvimento desejado e transfira larvas individuais para uma placa de teste com uma fina película de água. A água permite que as larvas se movam livremente sem grudar na superfície da placa.
As larvas de Drosophila detectam estímulos térmicos nocivos por meio de neurônios sensoriais multidendríticos em sua epiderme, conhecidos como nociceptores. Eles não disparam até que um certo limite sensorial seja atingido, como altas temperaturas potencialmente prejudiciais.
Defina a sonda de calor para uma temperatura que supere esse limite sensorial e faça com que os nociceptores disparem. Pressione suavemente a ponta da sonda contra a larva para aplicar calor. A larva responderá à temperatura nociva com comportamentos termonociceptivos, retirando-se da sonda. Pare quando a larva exibir um papel de 360 graus longe da sonda de calor ou quando um tempo definido tiver decorrido. Registre o tempo de resposta.
No protocolo de exemplo, veremos uma demonstração de um ensaio de sonda de calor localizado em larvas de Drosophila no início do terceiro ínstar.
- Primeiro, predefina a temperatura da sonda térmica para o ponto de ajuste desejado. Use um pincel ou fórceps para transferir suavemente uma larva individual para uma plataforma plana, garantindo que a lava seja coberta por uma fina película de água.
- Para minimizar a variação de pressão, bem como para garantir a localização e o ângulo corretos da sonda de calor, a prática leva à perfeição.
- Pressione suavemente a ponta da sonda contra a larva no segmento A4, aplicando uma leve pressão com a ponta em um ângulo de cerca de 45 graus entre a sonda e a superfície da larva. A pressão deve causar um leve recuo na superfície da larva e geralmente será suficiente para evitar a locomoção. Continue estimulando a larva até que uma resposta de retirada seja exibida ou até que o limite de 20 segundos seja atingido.
As larvas que respondem normalmente mostram primeiro um comportamento preliminar de levantar a cabeça e a cauda, seguido pelo comportamento de retirada de rolar pelo menos 360 graus. Depois que o comportamento de retirada for iniciado, libere o contato com a sonda e registre a latência ou o tempo necessário para a retirada. Se nenhum comportamento de abstinência for observado em 20 segundos, a larva não responde.