0 visualizações • 5:52 min. • April 30th, 2023
- Diferente dos vertebrados, o coração da Drosophila faz parte de um sistema circulatório aberto. O coração de uma mosca adulta é uma estrutura semelhante a um tubo construída a partir de cardiomiócitos que é conectada à epiderme por músculos alários e incorporada na matriz extracelular. A câmara cardíaca está na extremidade posterior da mosca e bombeia hemolinfa para a aorta, de onde flui para a cavidade corporal aberta.
Nos insetos, a hemolinfa serve como sangue e fluido intersticial, transportando nutrientes, moléculas sinalizadoras e células imunológicas. Pontos de referência adicionais do coração incluem óstios, que são aberturas ao longo do tubo, e válvulas intracardíacas. As células pericárdicas estão localizadas ao longo do tubo cardíaco e fazem parte do sistema excretor da mosca.
Em uma preparação experimental do coração, a hemolinfa artificial imita as condições fisiológicas para preservar a função do tecido. Embora a hemolinfa natural não seja responsável pelas trocas gasosas, a hemolinfa artificial deve ser bem oxigenada para substituir a falta de um sistema traqueal funcional. No experimento a seguir, demonstramos uma preparação cardíaca semi-intacta de uma mosca adulta para imagens ao vivo ou eletrofisiologia.
- Antes de começar, primeiro preparamos uma solução de hemolinfa artificial. Esta solução contém sacarose e trealose, que devem ser adicionadas à hemolinfa artificial a partir de soluções de estoque refrigeradas antes do uso, a fim de evitar a contaminação bacteriana. Leve a hemolinfa artificial à temperatura ambiente e oxigene a solução borbulhando ar por pelo menos 15 minutos.
Em seguida, puxe vários capilares finos usando um extrator de pipeta padrão, que será necessário para a remoção de corpos gordurosos na mosca.
Depois de tudo preparado, as moscas adultas devem ser anestesiadas. Isso pode ser feito usando uma breve exposição para tirar uma soneca por dois a cinco minutos, mas tome cuidado para não deixar as moscas na soneca por mais de cinco minutos. A exposição de curto prazo ao frio também pode ser usada para anestesiar moscas, mas o dióxido de carbono não é recomendado, pois tem efeitos mais duradouros na frequência cardíaca e na ritmicidade.
Em seguida, as moscas anestesiadas são colocadas, com o lado dorsal voltado para baixo, em uma placa de Petri revestida com uma fina camada de vaselina. A cutícula hidrofóbica nas asas e no corpo deve aderir reversivelmente à geleia, mas a mosca pode ser reposicionada, se necessário. Um corte inicial é feito usando uma tesoura de mola curva. Isso é feito colocando as lâminas da tesoura sob as pernas da mosca e inclinadas para baixo em direção à superfície dorsal do tórax, perto do pescoço.
A cabeça, o cordão nervoso ventral e as pernas são removidos com um único corte. Depois de cortada, a preparação é então submersa na solução de hemolinfa artificial oxigenada. Com a ajuda de uma tesoura de mola, a ponta posterior do abdome, que é composta pelos segmentos abdominais 7 e 8, é removida com um único corte. Isso fornece acesso para fazer cortes laterais ao longo de ambas as bordas do abdômen e serve para cortar a conexão entre o intestino posterior e a cutícula abdominal.
Insira as lâminas da tesoura na pequena abertura na ponta do abdômen e corte a cutícula lateralmente. Isso libera uma borda da cutícula ventral. Segure o retalho com uma pinça e faça um corte semelhante ao longo da borda lateral oposta do abdômen. O retalho liberado da cutícula abdominal ventral agora pode ser removido.
O intestino e outros órgãos abdominais geralmente podem ser removidos como uma única massa usando pinças de joalheiro e puxões suaves. A remoção dos órgãos internos revela o tubo cardíaco batendo, que ainda está preso à cutícula dorsal por pequenos músculos alares e é cercado por corpos gordurosos. Os capilares puxados são inseridos em tubos de plástico de 1/16 de polegada conectados a uma fonte de vácuo. A força de sucção é proporcional ao diâmetro da ponteira, portanto, pipetas com ponteiras maiores que 40 mícrons de diâmetro não devem ser usadas.
Uma vez configurado, este sistema de sucção é usado para sugar o excesso de gordura ao redor do tubo cardíaco. Também pode ser usado para remover bolhas de ar que se acumulam ao redor da cutícula e quaisquer detritos. Deve-se tomar extremo cuidado para evitar tocar no próprio coração e, como a porção posterior do coração é muito frágil, essa região deve ser evitada completamente. O tubo cardíaco adulto de Drosophila agora está exposto e deve estar batendo.
Se necessário, a cutícula e o coração anexado podem ser reposicionados levantando suavemente a cutícula da vaselina e compactando-a cuidadosamente de volta, evitando novamente qualquer contato com o tecido cardíaco. Neste ponto, a solução que banha a preparação deve ser substituída por hemolinfa artificial fresca. Esta preparação deve ser deixada em equilíbrio por 20 a 30 minutos com oxigenação antes de qualquer manipulação. Se a preparação for mantida por mais de 60 minutos, ela deve ser perfundida novamente com hemolinfa artificial fresca. Esta preparação está agora pronta para ser usada para registro óptico e também pode ser usada para registro eletrofisiológico ou para manipulações histológicas.