C. elegans Dissecção de blastômeros: um método para remover a casca do ovo e dissociar células embrionárias

- Para esta dissecção, use duas micropipetas: uma com uma abertura aproximadamente da mesma largura de um ovo e outra com o dobro da largura, e uma série de soluções organizadas em poços para facilitar a transferência rápida entre elas.

Primeiro, coloque hermafroditas adultos em solução de sal de ovo, que é osmoticamente equilibrada para evitar que os embriões estourem. Corte os vermes ao meio para liberar os embriões em desenvolvimento.

Em seguida, identifique embriões em estágio de duas células. Essas células são os blastômeros formados pela divisão do óvulo fertilizado. Use a micropipeta com a abertura maior para transferir um embrião para uma solução de hipoclorito, alvejante, que começará a quebrar a casca protetora do ovo.

Após apenas 40 a 55 segundos, transfira o embrião para o meio de crescimento de Shelton, ou SGM. Lave cada embrião brevemente em dois poços de SGM para remover todos os vestígios do alvejante antes de colocá-los em um terceiro poço.

Agora, use a micropipeta menor para pipetar repetidamente o embrião, fornecendo a força mecânica para remover a casca do ovo e expor os blastômeros. Continue a pipetar suavemente o embrião para separar as células individuais dos blastômeros. No protocolo a seguir, veremos essa técnica em ação.

- Segure cada extremidade de um microcapilar com capacidade de 10 microlitros com a mão direita e esquerda. Puxe o microcapilar em direção a ambas as extremidades para aplicar tensão e traga o centro do capilar sobre um queimador para fazer dois capilares puxados à mão.

Sob o microscópio de dissecação, apare as pontas dos capilares puxados à mão com uma pinça. Faça os dois tamanhos de abertura da ponta aproximadamente duas vezes e uma vez o comprimento do eixo curto dos embriões de C. elegans para a transferência de embriões e remoção da casca do ovo, respectivamente.

Conecte o capilar puxado em um aparelho de pipetagem bucal. Pipete 45 microlitros de solução de sal de ovo em um poço de uma lâmina de vários poços.

Coloque 5 a 10 adultos C. elegans no poço. Para obter embriões iniciais de C. elegans, corte os adultos em pedaços posicionando duas agulhas à direita e à esquerda do corpo de C. elegans e deslizando as agulhas uma sobre a outra.

Pipete 45 microlitros de solução de hipoclorito em um poço próximo ao poço contendo solução de sal de ovo e pipete 45 microlitros do meio de crescimento de Shelton nos três poços subsequentes. Transfira embriões em estágio de uma célula e em estágio inicial de duas células para a solução de hipochorito pela pipeta de boca com abertura de tamanho maior e aguarde 40 a 55 segundos.

Lave os embriões transferindo-os para os próximos três poços com o meio de crescimento de Shelton com 1 a 2 segundos em cada um dos dois primeiros poços. Usando o capilar desenhado à mão com uma abertura de tamanho menor, repita cuidadosamente a pipetagem do embrião para remoção da casca do ovo.

Depois disso, pipete continuamente com o capilar desenhado à mão para separar os blastômeros embrionários do estágio de duas células.

- Após a remoção da casca do ovo, minimize a força na pipetagem dos embriões para cima e para baixo para evitar o estouro.