0 visualizações • 3:10 min. • April 30th, 2023
- Comece com ovos peletizados que foram isolados pelo branqueamento de vermes adultos grávidas. Certifique-se de que cada etapa deste procedimento seja conduzida de forma estéril para evitar a contaminação das células cultivadas. Suspenda o pellet em uma solução de quitinase, uma enzima que decompõe a quitina - um grande polissacarídeo que é um componente estrutural da casca do ovo.
Após um período de digestão adequado, centrifugue suavemente os ovos e substitua o sobrenadante por meio de cultura celular para interromper a digestão. Em seguida, passe os embriões por uma agulha de calibre 18 para separar mecanicamente as células individuais. Em seguida, filtre a solução para remover detritos da casca do ovo ou aglomerados de células não separadas. Coloque as células em uma placa de cultura em uma lamínula de vidro revestida com aglutinina de amendoim - uma lectina que ajuda as células a se ligarem à lamínula, ligando os carboidratos da superfície celular.
No protocolo de exemplo, prepararemos células embrionárias para diferenciação e análise morfológica in vitro.
- Enquanto trabalha sob uma capela de fluxo laminar para evitar a introdução de contaminação bacteriana, ressuspenda os ovos peletizados em um mililitro de dois miligramas por mililitro de quitinase e transfira-os para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Balance o tubo por 10 a 30 minutos em temperatura ambiente, dependendo do frescor da enzima. Quando aproximadamente 80% das cascas dos ovos forem digeridas, centrifugue os ovos a 900 g por três minutos.
Depois de remover cuidadosamente o sobrenadante, adicione três mililitros de meio L15. Transfira os ovos para uma placa de seis centímetros de diâmetro e inicie a dissociação manual usando uma seringa estéril de 10 mililitros com uma agulha de calibre 18. Para monitorar o grau de dissociação, coloque uma gota de suspensão em uma placa de Petri fresca e veja ao microscópio. Continue até que aproximadamente 80% das células estejam dissociadas.
Para remover aglomerados de células, ovos não digeridos e larvas eclodidas, filtre suavemente a suspensão através de um filtro de cinco mícrons e passe mais quatro a cinco mililitros de meio L15 pelo filtro para recuperar as células. Para cultivar as células após centrifugação do filtrado a 900 g durante três minutos, ressuspender as células em meio L15 completo. Coloque um mililitro por poço e armazene as placas em uma câmara úmida e selada a 20 graus Celsius no ar ambiente.