C. elegans Ensaio de quimiotaxia: um método para testar a quimiossensação em vermes

- Para entender as condições encontradas e responder a elas de acordo, o verme C. elegans possui, entre outros, um sistema quimiossensorial altamente desenvolvido, capaz de detectar uma ampla variedade de produtos químicos diferentes.

Os neurônios sensoriais na cabeça, os neurônios anfidos e labiais internos, bem como os neurônios na cauda, os neurônios fasmídeos, são direta ou indiretamente expostos através da cutícula às condições externas. Esses neurônios quimiossensoriais codificam informações relevantes usadas pelo verme para produzir uma resposta comportamental apropriada: um comportamento denominado quimiotaxia.

Para testar a resposta quimiotática a odores voláteis ou a pistas gustativas solúveis em água, isolar os vermes da fase de desenvolvimento desejada e expô-los ao produto químico em estudo numa arena experimental previamente preparada. Quando exposto a produtos químicos favoráveis, como os produzidos por uma fonte de alimento bacteriano, C. elegans exibe quimiotaxia positiva em direção à fonte.

Inversamente, quando exposto a produtos químicos menos favoráveis ou tóxicos, como metais pesados, o verme exibe quimiotaxia negativa, evitando o produto químico. Assim, os mutantes olfativos ou gustativos não conseguem evitar produtos químicos aversivos e permanecem em condições desfavoráveis, em contraste com os animais selvagens que evitam a condição aversiva.

No protocolo de exemplo, veremos uma demonstração de um ensaio de quimiotaxia, testando a aversão do verme ao cobre.

- Após a incubação durante a noite, remova as placas da incubadora e, usando a parte inferior marcada da placa como guia, pipete 100 microlitros de solução de dois sulfatos de cobre 0,5 molar recém-preparada na borda do ágar para criar uma barreira externa de cobre. Pipete 25 microlitros da solução de cobre e dois sulfatos para criar uma barreira na linha média.

Certifique-se de que a solução de cobre e dois sulfatos não entre em contato com o adesivo bacteriano e deixe a solução de cobre secar na placa. Verifique se há ressecamento a cada cinco minutos após a transferência com um tecido de laboratório, esfregando levemente a solução perto da borda da placa para discernir.

Imediatamente antes do ensaio, transferir os organismos experimentais para uma placa de ágar livre de bactérias e permitir que os nematóides se movam livremente por um minuto para remover o excesso de bactérias.

Em seguida, pipete 1 mililitro de M9 na placa com adultos jovens que foram transferidos 24 horas antes para lavar os vermes em um tubo de microcentrífuga. Centrifugue os nematóides a 3.000 vezes g por um minuto.

Os vermes devem formar uma pelota no fundo do tubo. Aspirar a solução M9 sem interromper o pellet de minhoca. Adicione 1 mililitro de solução M9 ao pellet de minhoca. Inverta o tubo para misturar vermes com a solução.

Se o excesso de bactérias foi inicialmente transferido com os vermes, repita por um total de cinco vezes. Após a lavagem final, aspirar o sobrenadante até 100 microlitros de solução M9 e o pellet de minhoca permanecer. Transfira imediatamente os vermes da solução assim que as etapas de lavagem forem concluídas.

Pipete 20 microlitros do pellet de minhoca do fundo do tubo para a metade livre de bactérias da placa de ensaio. Certifique-se de que 10 minhocas sejam transferidas para a placa de ensaio e que nenhum alimento contaminante esteja presente. Nenhuma bactéria deve ser transferida para os pratos de cobre da corrida de alimentos.

Remova o excesso de solução M9 dos nematóides com um tecido de laboratório dentro de um minuto. Certifique-se de que a solução M9 não entre em contato com a solução de cobre e dois sulfatos e que os vermes e a superfície do ágar permaneçam intactos. Descarte os vermes que foram removidos acidentalmente com o tecido de laboratório.

Uma vez que a solução M9 tenha sido removida e todos os vermes tenham iniciado padrões locomotores não líquidos, ou seja, quando eles pararam de se debater, inicie o cronômetro do ensaio. Se vermes extras foram incluídos acidentalmente, remova-os escolhendo com óleo de halocarbono para garantir que nenhuma bactéria seja adicionada ao prato.

Verifique as placas de ensaio a cada 30 minutos. Para as placas de ensaio com manchas bacterianas, pontue positivamente os organismos se eles atingirem a mancha de alimento em um período de quatro horas. Para as placas de controle negativo, pontue positivamente os organismos se eles cruzaram a barreira.