C. elegans Rastreamento de movimento: um método para avaliar a locomoção em vermes

- Para avaliar a locomoção em C. elegans, use uma câmera para registrar o movimento dos vermes em uma placa de ágar, garantindo uma iluminação uniforme da placa durante a gravação. Para restringir o movimento das minhocas ao redor da placa, use anéis de cobre. O cobre é aversivo para C. elegans, então os vermes são encurralados dentro dos anéis.

Coloque vários anéis de cobre em uma placa para rastrear simultaneamente os vermes em cada anel. Isso permite que a avaliação de animais de controle e experimentais seja realizada em condições idênticas, reduzindo a variabilidade do dia a dia e permitindo comparações lado a lado. Registre o movimento dos vermes em intervalos de tempo definidos e use um software de computador para analisar características do comportamento da locomotiva, como a velocidade do movimento e a distância percorrida.

No protocolo de exemplo, veremos uma demonstração de um ensaio de rastreamento de movimento testando os efeitos do álcool na velocidade de locomoção do verme.

- Para começar, leve dois minutos ou menos para transferir 10 minhocas de cada grupo experimental para o centro de um anel de cobre em uma placa de aclimatação. Esta é uma placa sem etanol. Evite transferir alimentos com as minhocas, pois isso reduzirá seu movimento. Evite também danificar a superfície do ágar porque os vermes se enterrarão. Registre o tempo de carregamento na placa e certifique-se de escalonar a transferência de minhocas para cada placa em mais de dois minutos, para que cada placa possa ser filmada individualmente no intervalo de tempo apropriado.

Deixe cada placa de aclimatação incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, transfira as minhocas para a placa de ensaio, seguindo a ordem usada para colocar as minhocas na placa de aclimatação. Usando um picareta de minhoca achatada de borda fina sem bactérias, colete as minhocas em cima da picareta achatada usando um movimento de escavação. Em seguida, sele a placa com filme de laboratório para minimizar a perda de etanol por vaporização.

- A velocidade com que os animais são transferidos nesta etapa é muito importante, porque os animais transferidos ficarão expostos ao etanol por mais tempo. Portanto, é uma boa ideia alternar quais cepas são colocadas na placa primeiro entre as réplicas experimentais.

- Um microscópio com câmera de vídeo de alta resolução é necessário para filmar os vermes agora. Mesmo a iluminação, como a de uma luz de fundo quadrada de três polegadas, é vital para a análise. Em seguida, para manter o contraste, crie uma imagem da placa com o lado da mídia voltado para cima.

Prepare o software de análise de imagem para capturar filmes de 120 quadros, 12 bits, em tons de cinza e lapso de tempo em um quadro por segundo. Para reduzir o tamanho do arquivo de saída, mantendo a resolução de imagem suficiente, use um modo de compartimentalização dois por dois.

Agora grave filmes de dois minutos de cada placa, 10 minutos depois que os últimos vermes foram colocados nessa placa. Em seguida, faça uma segunda gravação de dois minutos, 30 minutos após os vermes terem sido colocados na placa. Para esta demonstração é utilizado o software Image-Pro Plus, pois uma grande variedade de outros softwares pode ser adaptada à técnica. Analise os filmes como segmentos de dois minutos.

Primeiro, aplique um filtro às imagens que nivela o fundo e aumenta o contraste dos objetos de minhoca. No menu, selecione Processar, Filtros, Aprimoramento e Nivelar. Defina o parâmetro para um plano de fundo escuro e uma largura de recurso de 20 Pix.

Agora, analise a locomoção dos animais em cada anel separadamente com uma região circular de interesse que se sobrepõe ao anel de cobre. Identifique e rastreie os worms com o comando Rastrear objetos no submenu Medir.

Na janela Tabela de Dados de Rastreamento, use o botão Opções de Rastreamento para permitir que trilhas específicas sejam excluídas e para limitar quaisquer artefatos experimentais. Na guia Rastreamento automático, defina os parâmetros de rastreamento para um limite de velocidade de 400 mícrons por quadro. Defina o Limite de aceleração como Automático.

Defina o Comprimento total mínimo da trilha como 400 mícrons e defina o Tipo de movimento predominante como Caótico. Em seguida, no parâmetro de trilha, defina os objetos para permitir que as trilhas parciais tenham um comprimento mínimo de 21 quadros e tenham uma profundidade de projeção de rastreamento de um quadro.

Agora, para iniciar o processo de rastreamento, primeiro clique no botão de função Localizar todas as faixas automaticamente. Isso abre a caixa de diálogo Opções de Contagem/Tamanho e a caixa de Diálogo de Rastreamento. Selecione a opção Manual para a Seleção de faixa de intensidade na caixa de diálogo Contagem/Tamanho. Isso fornece uma etapa de limite importante. Em seguida, ajusta os controles deslizantes de Limite de intensidade para criar um intervalo inclusivo que realça objetos escuros. Um bom ponto de partida na escala é entre 0 e 1.500.

Agora aplique um filtro de tamanho para excluir objetos maiores ou menores que um único worm. Vá para o menu Medir e selecione o submenu Medição. Isso abre a caixa de diálogo Opções de contagem/tamanho. Lá, defina o intervalo de área para 28.000 a 120.000 mícrons quadrados. E defina a faixa de perímetro para 600 a 2.500 mícrons. Faça ajustes nesses parâmetros ao usar vermes de tamanho anormal.

Agora, conclua o processo de rastreamento clicando em Continuar na caixa de diálogo de rastreamento. Verifique se a saída acompanha a filmagem. Certifique-se de que todos os worms estejam representados, a menos que haja um motivo claro para filtrá-los. Em seguida, exclua manualmente as faixas produzidas por objetos que não sejam worms.

Em seguida, calcule a velocidade de cada verme calculando a média da distância percorrida entre cada quadro ou a cada segundo e crie uma velocidade média para as trilhas em cada população. Considere esta média final como um ponto de amostragem para análise estatística do experimento.