0 visualizações • 2:23 min. • April 30th, 2023
- Coloque um verme transgênico expressando GCaMP - uma proteína sensível ao cálcio - em uma câmara de imagem junto com alimento bacteriano para o verme. Em seguida, sele o prato com a tampa e o filme de laboratório para evitar a evaporação. Visualize-o sob um microscópio composto equipado para epifluorescência de campo amplo. Registre imagens de lapso de tempo dos vermes para rastrear seu comportamento e capturar fluorescência usando software de imagem.
Os vermes transgênicos expressam uma proteína sensor de GCaMP sob o controle de um promotor que impulsiona a expressão de GCaMP em um neurônio específico. Quando esse neurônio é ativado, ele dispara um potencial de ação, que despolariza a membrana plasmática. Após a despolarização, os canais de cálcio dependentes de voltagem se abrem na membrana plasmática. Isso causa um influxo de íons de cálcio na célula, resultando em excitação neuronal.
GCaMP no neurônio excitado se liga aos íons de cálcio. Isso faz com que o GCaMP fique fluorescente quando os vermes são fotografados com uma luz de excitação de fluorescência de baixa intensidade. No protocolo de exemplo, usaremos imagens de cálcio para visualizar a atividade do interneurônio AVA em C. elegans transgênicos em microcâmaras de agarose.
- A imagem de cálcio é realizada em um microscópio composto equipado para epifluorescência de campo amplo. Para limitar a exposição à luz, use um sinal lógico de transistor-transistor que aciona um LED para iluminar a amostra ao mesmo tempo em que a câmera grava um quadro.
Execute um filme em sequência por 24 horas que cria imagens de cada worm a cada 15 a 30 minutos. Primeiro, registre 20 segundos com DIC, depois 20 segundos com fluorescência GFP e, finalmente, uma imagem do sinal mKate2 para controlar os níveis de expressão.
Para inspeção visual de dados, use um mapa de cores falsas para aumentar a visibilidade de pequenas mudanças na intensidade da fluorescência. Por fim, execute a análise de dados de cálcio usando procedimentos padrão.