Lesão epidérmica a laser: induzindo danos localizados para examinar processos de reparo em C. elegans

- Para começar, transfira os vermes adultos jovens para uma almofada de agarose fresca em uma lâmina. Em seguida, adicione algumas gotas de solução de levamisol 12 milimolares para paralisar os vermes. Cubra as minhocas com uma lamínula e aguarde alguns minutos. Coloque a lâmina sob um microscópio confocal de disco giratório e concentre-se na superfície mais externa lateral do verme.

A epiderme de um verme adulto é uma estrutura fina de camada única que consiste em sincícios multinucleados que resultam de eventos de fusão celular. A superfície apical da epiderme secreta uma cutícula colagenosa flexível, enquanto a superfície basal é coberta por uma fina camada de matriz extracelular chamada lâmina basal.

Em seguida, enrole a superfície apical da epiderme com um laser. O citoplasma das células danificadas pode vazar, aparecendo como uma bolha no local da ferida.

A irradiação a laser tem vantagem sobre outras técnicas, como o ferimento por agulha, pois causa ruptura localizada da cutícula e das células epidérmicas, sem danificar os tecidos internos. No protocolo de exemplo, veremos o processo de ferimento a laser em C. elegans.

- Para enrolar com precisão os nematóides, este protocolo usa um laser de femtossegundo conectado ao microscópio confocal de disco giratório. Varreduras de linha ou ponto usando lasers de femtossegundo, como aqueles em microscópios de dois fótons, também devem ser suficientes.

- Comece coletando 10 jovens adultos em uma almofada de ágar. Paralisar-os em uma gota de dois microlitros de solução de levamisol 12 milimolares. Em seguida, cubra-os com uma lamínula e espere alguns minutos enquanto eles paralisam.

- É essencial que um animal esteja completamente paralisado. 12 milimolares de levamisol não afetará a resposta da ferida. No entanto, outros métodos de imobilização também podem ser usados.

- Certifique-se de que a potência do laser de femtossegundo esteja definida para 140 miliwatts, conforme medido antes da objetiva, e que a taxa de repetição do laser esteja em 80 megahertz. Agora, localize os vermes sob um microscópio confocal de disco giratório. Usando uma objetiva de 100x com uma alta abertura numérica, concentre-se na epiderme sincicial anterior ou posterior lateral do verme alvo.

Concentrando-se na superfície apical da célula epidérmica, brilhe o laser por dois pulsos de 200 milissegundos separados por 20 milissegundos. Isso deve ser suficiente para ferir a epiderme. Espere um momento e observe a ruptura local do citoplasma, que aparecerá como borbulhamento. Se um marcador fluorescente estiver presente, pode-se observar clareamento localizado.