0 visualizações • 2:56 min. • April 30th, 2023
- C. elegans é usado como um modelo experimental de infecção por patógenos intestinais que causam doenças, em parte, por romper a barreira intestinal, aumentando sua permeabilidade. Para quantificar a integridade da barreira após a exposição a uma bactéria ou composto químico de interesse, colete vermes lavando-os de seus pratos.
Em seguida, coloque esses vermes em placas de ágar com alimentos rotulados compostos de E. coli morta pelo calor misturada com FITC-dextrano, um polissacarídeo de alto peso molecular com uma etiqueta fluorescente.
Permita que os vermes comam as bactérias rotuladas. Aqueles com barreiras intestinais intactas eliminam rapidamente o alimento, enquanto em vermes com intestinos mais permeáveis, o marcador fluorescente penetra além do lúmen do órgão.
Transfira os vermes para uma solução de formaldeído para fixar os animais. Após 1 a 2 minutos, substitua o formaldeído por um meio de montagem.
Finalmente, imagine os vermes por microscopia fluorescente. Observe que os grânulos intestinais de C. elegans são autofluorescentes, portanto, haverá sinal de fundo. Mas, no geral, mais fluorescência intestinal indica maior permeabilidade.
No protocolo de exemplo, vamos testar o efeito do tratamento com a biomolécula DIM na permeabilidade intestinal de vermes infectados com bactérias patogênicas Pseudomonas aeruginosa.
- Prepare as placas suplementadas com FITC-dextrana misturando 2 mililitros de E. coli inativada pelo calor com 4 miligramas de FITC-dextrana. Adicione 100 microlitros da mistura a cada uma das 20 placas de ágar NGM frescas e deixe as placas secarem por uma hora em uma bancada de laboratório limpa. Após 48 horas de tratamento, lave as minhocas com S Buffer. Transfira-os para placas suplementadas com FITC-dextrano e para placas NGM sem FITC-dextrano e incube as placas durante a noite.
No dia seguinte, lave as minhocas com S Buffer e deixe-as rastejar na placa de ágar NGM fresca por uma hora. Adicione 50 microlitros de formaldeído a 4% a cada poço de uma placa preta de fundo plano de 96 poços e transfira aproximadamente 50 minhocas para cada poço. Após 1 a 2 minutos, remova todo o formaldeído e adicione 100 microlitros de meio de montagem em cada poço.
- O formaldeído é um produto químico tóxico e deve ser manuseado com cuidado.