0 visualizações • 3:40 min. • April 30th, 2023
- A criação de matrizes de DNA extracromossômico por microinjeção - o método mais simples para gerar cepas de vermes transgênicos - resulta em elementos genéticos que não são transmitidos de forma estável durante a divisão celular e, portanto, exibem taxas de herança e níveis de expressão variáveis. O objetivo de integrar a matriz em um cromossomo é diminuir essa instabilidade e variabilidade genética.
Para fazer isso, comece com uma população sincronizada com a idade de vermes transgênicos L4, que carregam uma matriz extracromossômica previamente introduzida por microinjeção e permitem que eles se transformem em adultos grávidas. Transfira esses adultos para novos pratos e deixe-os botar ovos até que haja pelo menos 30 ovos em cada prato. Remova os adultos e deixe os ovos crescerem até atingirem o estágio L4. Em seguida, irradie os vermes com luz ultravioleta. Isso causa quebras aleatórias de fita dupla no DNA genômico, onde o maquinário de reparo de DNA de vermes pode incorporar arbitrariamente a matriz.
Após um período de recuperação durante a noite, conte o número de vermes sobreviventes. Uma pequena porcentagem de vermes mortos indica irradiação eficiente. Observe as gerações subsequentes para isolar linhagens transgênicas integradas homozigóticas. No protocolo de exemplo, integraremos uma matriz extracromossômica de alta taxa de transmissão carregando um marcador de co-injeção fluorescente expresso na faringe.
- Avaliar a taxa de transmissão da linhagem transgênica a ser integrada. Para cada linha transgênica, escolha 10 adultos grávidas fluorescentes em 10 placas de cultura separadas sob um estereoscópio fluorescente. Cultive os animais em uma incubadora de minhocas ajustada a uma temperatura permissiva à reprodução do fundo genético.
Monitore a progênie todos os dias para avaliar em qual estágio de desenvolvimento o marcador de co-injeção é expresso e pode ser melhor observado. Usando estereoscopia fluorescente, avalie a taxa de transmissão da progênie determinando a porcentagem de progênie fluorescente. Para a integração do transgene, selecione a linha transgênica com a maior taxa de transmissão.
Obter uma população de animais transgênicos sincronizados no estágio larval L4 para integração. Escolha 30 adultos grávidas fluorescentes em cinco placas de cultura. Depois que os vermes botarem ovos por três a quatro horas a 15 graus Celsius, verifique a presença de pelo menos 30 ovos por placa e, em seguida, elimine os adultos das placas.
Cultivar os animais em incubadora de minhocas até que a progênie atinja o estágio larval L4. Coloque cada placa contendo 15 a 20 animais transgênicos fluorescentes L4 em um reticulador UV com as tampas removidas. Irradie os vermes.
Para recuperação, incube os vermes irradiados durante a noite a 15 graus Celsius. Verifique o número de animais vivos. Em nossas mãos, uma taxa de sobrevivência de cerca de 80% a 90% é adaptativa para uma irradiação eficiente. Cultivar os animais irradiados a uma temperatura de 15 a 25 graus Celsius até que a progênie atinja o estágio de desenvolvimento, permitindo a observação da expressão do marcador de co-injeção.