Injeção intramuscular (IM): entrega composta no músculo dorsal de um peixe-zebra adulto

- Transfira um peixe anestesiado com tricaína para uma esponja úmida com o lado dorsal voltado para cima. Coloque a esponja que transporta o peixe sob um microscópio. Posicione uma agulha de microinjeção em um ângulo de 45 graus do eixo do corpo próximo ao músculo dorsal.

Em seguida, localize o local na frente da barbatana dorsal que não esteja coberto de escamas, onde você pode inserir a agulha sem aplicar muita força. Em seguida, insira suavemente a agulha e injete lentamente o composto de interesse junto com um marcador como o vermelho de fenol no músculo.

Se o composto de interesse contiver material genético, eletropore as células colocando eletrodos em ambos os lados do local da injeção e administrando a corrente. A corrente torna as células musculares permeáveis e capazes de absorver eficientemente o material genético. Após o procedimento, transfira imediatamente o peixe para um tanque de recuperação. No protocolo a seguir, realizaremos uma injeção intramuscular em um peixe-zebra adulto para administrar uma vacina de DNA contra micobacteriose.

Para manter o peixe em uma posição fixa durante a injeção, use um pedaço de esponja com uma ranhura cortada no meio como acolchoamento. Mergulhe bem a esponja na água do sistema e coloque-a em uma placa de Petri. Usando uma colher de plástico, transfira um peixe-zebra anestesiado para a esponja úmida com o lado ventral do peixe voltado para baixo no sulco. Sob o microscópio, coloque a agulha em um ângulo de 45 graus próximo ao músculo dorsal do peixe-zebra. Em seguida, encontre o pequeno ponto sem escamas na frente da barbatana dorsal e empurre a agulha para dentro do músculo.

Se alguma resistência for sentida, tente um local adjacente. Use um pedal para injetar gradualmente a solução de plasmídeo no músculo. Sob o microscópio, o vermelho de fenol deve ser visível ao entrar no tecido muscular.

Eletroporar o peixe imediatamente após a injeção, colocando os eléctrodos do tipo pinça de cada lado do local de injecção. Pressione o botão Iniciar no eletroporador e dê a ele seis pulsos de 40 volts e 50 milissegundos. Em seguida, transfira suavemente o peixe para um tanque de recuperação. Finalmente, depois de anestesiar os peixes de acordo com o protocolo de texto, use uma luz ultravioleta para ver a expressão do EGFP perto do local da injeção.