Ensaio XTT: Um ensaio colorimétrico para avaliar a viabilidade celular e a atividade mitocondrial

- As ondas de ultrassom de baixa frequência levam à lise seletiva das células de leucemia humana e o ensaio XTT ajuda a determinar o grau desse dano. O ensaio funciona com base no princípio de que as enzimas mitocondriais de células saudáveis convertem um corante XTT amarelo em um composto laranja chamado formazan. Para iniciar o ensaio, trate as células com metil beta-ciclodextrina, um agente destruidor de colesterol e, posteriormente, sonique as células em baixa potência para induzir danos celulares.

Centrifugue para peletizar as células e adicione meios de crescimento celular frescos ao pellet. Semeie as células na concentração desejada em uma microplaca de vários poços e incube-a durante a noite. Agora, adicione a solução de XTT ativada às células e incube até que a cor laranja se desenvolva nos poços da microplaca. Colocar a placa num espectrofotómetro. Meça a absorbância em 450 a 500 nanômetros e depois em 630 a 690 nanômetros. Subtraia os dois valores para obter resultados precisos. O maior valor de absorbância no ensaio XTT indica a maior atividade das enzimas mitocondriais e maior viabilidade celular.

No vídeo a seguir, demonstraremos o uso do ensaio XTT para determinar a eficácia das ondas de ultrassom de baixa frequência para causar danos celulares em células de leucemia tratadas com metil beta ciclodextrina.

- Para avaliar a viabilidade das células sonicadas pelo ensaio XTT, sonicar as células usando uma faixa de um a três pulsos de um segundo, com base em um segundo de intervalo, para desenvolver uma gama de danos para o kit XTT avaliar. Em seguida, gire as células e ressuspenda os grânulos para 1 vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro em meio de crescimento recém-preparado. Em seguida, semeie 100 microlitros de células por poço em placas de microtitulação individuais de fundo plano de 96 poços em triplicata, incluindo três poços de controle contendo 100 microlitros de meio de crescimento completo sozinho para leituras de absorbância em branco. Incube as células por 24 horas.

Na manhã do ensaio, gire suavemente alíquotas de XTT aquecido a 37 graus Celsius e reagentes de ativação até que as soluções estejam claras. Em seguida, adicione 0,1 mililitros do reagente de ativação a uma alíquota de 5 mililitros do reagente XTT. Em seguida, adicione 50 microlitros da solução XTT ativada a cada poço das placas inoculadas com U937 e THP1 e retorne as células à incubadora de cultura de células. Após duas horas, agite as placas suavemente para distribuir uniformemente o corante laranja nos poços positivos e meça a absorbância em um leitor de placas de microtitulação entre 450 e 500 nanômetros. Finalmente, meça a absorbância de todos os poços de ensaio novamente entre 630 e 690 nanômetros.