JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 3:24 min • April 30th, 2023
- Bromodeoxiuridina ou BrdU é um análogo sintético do nucleosídeo da timidina. Durante a fase de síntese do ciclo celular, o BrdU substitui a timidina e se integra ao DNA recém-sintetizado. O BrdU incorporado permite o rastreamento da progressão do ciclo celular. Para detectar o BrdU incorporado, primeiro fixe e permeabilize as células para torná-las permeáveis.
Em seguida, trate as células com a enzima DNAse para clivar as fitas de DNA e expor o BrdU incorporado. Em seguida, adicione um anticorpo anti-BrdU marcado com fluorescência adequado. O anticorpo entra no núcleo e se liga prontamente ao BrdU exposto presente no DNA.
Além disso, trate as células com um corante fluorescente adequado de ligação ao DNA. O corante se liga ao DNA, permitindo a quantificação do conteúdo total de DNA. Use citometria de fluxo para detectar a fluorescência de BrdU e DNA marcados.
As intensidades de fluorescência do DNA marcado diferenciam as células em diferentes fases do ciclo celular com base na variação no conteúdo total de DNA. O sinal fluorescente de BrdU identifica a posição atual do ciclo celular das células incorporadas ao BrdU.
Neste exemplo, realizaremos a coloração imunofluorescente BrdU de células de leucemia linfoblástica aguda NALM-6.
- Antes da coloração de anticorpos, trate as células com DNAse. Ressuspenda as células em 100 microlitros de solução de DNAse e incube por uma hora a 37 graus Celsius. Adicione um mililitro de tampão de lavagem, centrifugue as células e descarte o sobrenadante. A coloração de anticorpos para marcadores intracelulares diferentes de BrdU pode ser realizada simultaneamente com a coloração de BrdU.
- É importante preparar controles de compensação que consistem em células não coradas e células marcadas com cada fluorocromo. Idealmente, use os mesmos anticorpos para controles de compensação que os usados nos tubos experimentais.
- Ressuspendeu as células em 50 microlitros de tampão de lavagem com um microlitro por 10 para as 6 células do anticorpo BrdU. Se estiver usando anticorpos para outros antígenos intracelulares específicos, eles devem ser adicionados neste momento. Incube as células por 20 minutos em temperatura ambiente.
Após 20 minutos, lave as células com um mililitro de tampão de lavagem, conforme mostrado anteriormente. Finalmente, core o DNA para análise do ciclo celular. Afrouxe o pellet sacudindo o tubo e adicione 20 microlitros da solução de 7-AAD. É fundamental usar uma quantidade constante de 7-AAD por célula. Ressuspenda as células em um mililitro de tampão de coloração. Posteriormente, realizar a análise de citometria de fluxo.