Co-cultura 2D de células leucêmicas com BMSCs: um método para obter subpopulações de células leucêmicas

- Em um sistema de co-cultura 2D, vários tipos de células são cultivados juntos em placas de cultura planas. Este sistema de cultura facilita o estudo das interações e do comportamento celular in vitro. Para estabelecer a co-cultura de células leucêmicas com células estromais da medula óssea, ou BMSCs, adicione a suspensão de células leucêmicas a uma cultura de monocamada aderente de BMSCs. Incube a placa sob condições de cultura apropriadas. Manter a co-cultura substituindo 90% do meio de cultura a cada quatro dias.

Durante esta co-cultura 2D, as células leucêmicas interagem com as BMSCs e se localizam em regiões distintas da cultura, formando três subpopulações. A microscopia de contraste de fase permite diferenciar visualmente as três subpopulações. O primeiro grupo de células leucêmicas que aparece flutuando livremente no meio é categorizado como células suspensas. O segundo grupo de células leucêmicas que aderiram à superfície da monocamada BMSC parece brilhante e são categorizadas como células de fase brilhante.

O terceiro grupo de células leucêmicas que migraram abaixo da monocamada parece fraca e é categorizada como células de fase fraca. No protocolo a seguir, realizamos a co-cultura de células de Leucemia Linfoblástica Aguda, ou LLA, com células estromais da medula óssea humana.

- Comece semeando 5 a 20 vezes 10 até a sexta células leucêmicas em 10 mililitros de meio de cultura específico do tumor em uma placa de 100 milímetros de 80% a 90% de células estromais confluentes da medula óssea ou osteoblastos. De quatro em quatro dias, inclinar a placa para o lado e aspirar tudo, exceto 1 mililitro do meio, tomando cuidado para não perturbar a camada celular aderente. Em seguida, adicione cuidadosamente 9 mililitros de meio de cultura de células leucêmicas frescas no canto da placa ao longo do lado para garantir uma interrupção mínima das células aderentes.

Após o 12º dia de co-cultura, pipetar suavemente o meio de cultura para cima e para baixo sobre a placa aproximadamente 5 a 10 vezes para coletar as células leucêmicas flutuantes e transferir as células para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, semeie novamente as células em uma nova placa de 80% a 90% de células estromais da medula óssea confluentes ou osteoblastos, como acabamos de demonstrar. No dia 4, três subpopulações de células leucêmicas terão se formado, com as células leucêmicas suspensas flutuando livremente no meio, as células leucêmicas de fase brilhante aderidas à superfície da monocamada de células aderentes e as células leucêmicas de fase fraca migrando para baixo da monocamada.