Classificação de células de leucemia baseada em coluna G-10: um método para purificar células de leucemia linfoblástica aguda de células estromais da medula óssea

- Para começar, adicione tripsina a uma placa contendo células de leucemia co-cultivadas com células estromais da medula óssea para dissociação celular. Centrifugue e ressuspenda o pellet usando meios pré-aquecidos para manter a viabilidade celular. A coluna G-10 contém grânulos de dextrano reticulados que incham na água para formar uma matriz de gel.

Equilibre a coluna G-10 com mídia pré-aquecida para preencher o espaço entre as contas, garantindo uma ilusão lenta da mídia da coluna. Mantenha uma temperatura adequada na coluna para evitar a formação de bolhas de ar. Carregue a mistura de células lentamente nas esferas de gel na coluna G-10. Incube as células na coluna G-10 à temperatura ambiente pela duração desejada. Com base nas características e tamanho da superfície celular, as esferas de gel restringem preferencialmente as células estromais maiores da medula óssea, permitindo a separação das células leucêmicas.

Adicione meios pré-aquecidos à coluna e colete a suspensão das células de leucemia. Centrifugar a suspensão celular e ressuspender o pellet num tampão adequado. Use a população pura de células de leucemia para análise posterior. No exemplo a seguir, separaremos uma população pura de células leucêmicas da co-cultura estromal usando a coluna G-10.

- Com a torneira completamente fechada para cada subpopulação, use uma pipeta de 1000 microlitros para adicionar todo o volume de 1 mililitro de células, gota a gota, no topo de uma das colunas G-10 preparadas, certificando-se de que as células permaneçam em cima ou dentro do grânulo G-10. Deixe as células incubarem no gpellet G-10 por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 1 a 3 mililitros de meio fresco pré-aquecido à coluna e abra a torneira para que o meio saia lentamente das colunas em forma de gota.

Continue a adicionar meio pré-aquecido às colunas em incrementos de 1 a 2 mililitros. Quando um total de 15 a 20 mililitros de células leucêmicas tiver sido coletado, feche a torneira e tampe o tubo de coleta. Em seguida, gire as células e ressuspenda o pellet no tampão de análise a jusante apropriado.