Amostragem de sangue retro-orbital: um método para isolar células mononucleares do seio retro-orbital de um camundongo

- Primeiro, segure um rato anestesiado pelo pescoço e projete o olho. Insira um tubo capilar fino no canto medial do olho. Permita que o sangue flua por ação capilar para um tubo. Transfira o sangue para um tubo revestido com EDTA e mantenha-o no gelo. O EDTA se liga aos íons de cálcio, impedindo a coagulação do sangue. A temperatura mais baixa reduz a atividade glicolítica das células e as chances de contaminação microbiana.

Em seguida, dilua o sangue com um tampão contendo EDTA e misture bem. Adicione cuidadosamente uma camada de uma solução separadora apropriada ao fundo, sem perturbar o sangue. Centrifugue a suspensão. O polímero na solução de separação agrega os glóbulos vermelhos e sedimentos no fundo. As células mononucleares e as plaquetas, sendo mais leves que o polímero, depositam-se acima do gradiente polimérico.

Remova a camada superior contendo plasma e colete o anel branco opaco contendo células mononucleares. Dilua as células usando PBS e centrifugue para remover o plasma residual e as plaquetas. Use as células mononucleares isoladas para análise posterior. O protocolo a seguir demonstrará o isolamento de células mononucleares de um camundongo congênico injetado com