Amostragem de sangue retro-orbital: um método para isolar células mononucleares do seio retro-orbital de um camundongo

0 vistas3:18 min • April 30th, 2023

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- Primeiro, segure um rato anestesiado pelo pescoço e projete o olho. Insira um tubo capilar fino no canto medial do olho. Permita que o sangue flua por ação capilar para um tubo. Transfira o sangue para um tubo revestido com EDTA e mantenha-o no gelo. O EDTA se liga aos íons de cálcio, impedindo a coagulação do sangue. A temperatura mais baixa reduz a atividade glicolítica das células e as chances de contaminação microbiana.

Em seguida, dilua o sangue com um tampão contendo EDTA e misture bem. Adicione cuidadosamente uma camada de uma solução separadora apropriada ao fundo, sem perturbar o sangue. Centrifugue a suspensão. O polímero na solução de separação agrega os glóbulos vermelhos e sedimentos no fundo. As células mononucleares e as plaquetas, sendo mais leves que o polímero, depositam-se acima do gradiente polimérico.

Remova a camada superior contendo plasma e colete o anel branco opaco contendo células mononucleares. Dilua as células usando PBS e centrifugue para remover o plasma residual e as plaquetas. Use as células mononucleares isoladas para análise posterior. O protocolo a seguir demonstrará o isolamento de células mononucleares de um camundongo congênico injetado com uma linhagem de células leucêmicas C1498.

- Insira um tubo capilar no canto medial do olho do animal leucêmico anestesiado. 100 a 200 microlitros de sangue serão retirados do seio orbital para o tubo capilar. Remova o tubo e controle o sangramento com a aplicação suave de uma esponja de gaze estéril no olho. Em seguida, transfira o sangue para um tubo de EDTA e armazene o tubo no gelo até o isolamento da célula mononuclear.

Para isolar as células mononucleares do sangue, primeiro adicione PBS suplementado com EDTA 1 milimolar até um volume final de 500 microlitros. Em seguida, transfira a amostra para um tubo de microcentrífuga. Em seguida, use uma seringa de 1 mililitro equipada com uma agulha de calibre 30 para colocar cuidadosamente 500 microlitros de solução separadora sob o sangue, tomando cuidado para não misturar as camadas.

Separe as células por centrifugação e use uma pipeta para transferir a camada de células mononucleares brancas opacas para um novo tubo de microcentrífuga. Em seguida, lave as células imunológicas em 1 mililitro de PBS. Centrifugue-os e ressuspenda o pellet em 600 microlitros de tampão FACS para coloração e análise por citometria de fluxo.

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Última atualização: 1 agosto 2026