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- Em pacientes com leucemia linfocítica crônica, ou LLC, os linfócitos das células B aumentam significativamente na medula óssea e no sangue. Para isolar essas células da LLC de uma amostra de sangue, primeiro trate a amostra com um coquetel de enriquecimento de células B humanas que separa as células B usando seleção negativa. Os anticorpos no coquetel reconhecem e reticulam especificamente os antígenos expressos por células não B e eritrócitos, formando complexos densos.
Em seguida, coloque a amostra em camadas sobre um meio de gradiente de densidade com uma densidade ideal para isolamento de linfócitos. Com a centrifugação subsequente, os diferentes componentes sanguíneos se separam com base nas variações em suas densidades em relação ao meio gradiente. Os complexos de hemácias-não-células B com densidades mais altas se depositam através do meio, formando um pellet. A fração de plasma menos densa forma a camada superior. As células LLC menos densas formam uma camada branca na interface do meio de densidade plasmática.
Transfira cuidadosamente a camada branca para um tubo novo. Centrifugue novamente para obter um pellet contendo células LLC purificadas. No protocolo a seguir, mostramos o isolamento de células de leucemia linfocítica crônica, a partir de amostras de sangue de pacientes.
- Obtenha amostras de sangue periférico de pacientes com leucemia linfocítica crônica previamente consentida em tubos de coleta de sangue EDTA acompanhados da contagem de glóbulos brancos.
- As amostras de sangue humano devem ser consideradas perigosas, pois podem conter vírus transmitidos pelo sangue. Certifique-se de que essas amostras sejam manuseadas em um Gabinete de Biossegurança Classe II e que o usuário esteja usando jaleco e luvas o tempo todo. Descarte os materiais contaminados com sangue e desinfete-os.
- Se a contagem de glóbulos brancos for igual ou superior a 40 milhões de células por mililitro, dilua a amostra na proporção de 1 para 1 com tampão de lavagem RT CLL. Em seguida, alíquota do meio de gradiente de densidade RT em um tubo de centrífuga cônico de tamanho apropriado para a amostra. Colocar cuidadosamente a amostra sobre o meio e centrifugar a 400 vezes G durante 30 minutos em RT.
Usando uma pipeta de pasteur de plástico, colha suavemente a camada branca de células mononucleares que se acumularam na interface do meio de gradiente de densidade e do tampão de lavagem CLL. Transferir esta monocamada isolada para um novo tubo de centrifugação cónico de 50 ml. Para lavar as células, adicione 40 mililitros de tampão de lavagem CLL a esta monocamada e centrifugue a 300 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente.
Descarte o sobrenadante, sacuda o fundo do tubo para ressuspender o pellet e repita essa lavagem. Descarte o sobrenadante, sacuda novamente o fundo do tubo e, em seguida, suspenda novamente o pellet celular em um volume definido de tampão de lavagem CLL, dependendo do tamanho do pellet. Depois de contar as células e após a citometria de fluxo para verificar a pureza celular, coloque as células em placas de cultura de tecidos com a densidade celular necessária, prontas para estimulação ou tratamento medicamentoso.