JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 4:39 min • April 30th, 2023
- O ensaio de fluxo extracelular ajuda a estudar o metabolismo celular medindo as duas principais vias de energia - glicólise e respiração mitocondrial. Durante a glicólise, as células metabolizam a glicose e secretam lactato no espaço extracelular junto com os prótons, determinados pela medição da Taxa de Acidificação Extracelular ou ECAR. Durante a respiração mitocondrial, as células utilizam oxigênio para a produção de ATP, medido pela determinação da Taxa de Consumo de Oxigênio ou OCR.
As células cancerígenas exibem alta captação de glicose à medida que alteram sua taxa metabólica para se adaptar e manter a proliferação celular desregulada. Para analisar o metabolismo em células cancerígenas, primeiro monte uma microplaca de análise de fluxo contendo monocamada de células cancerígenas aderentes e um cartucho sensor hidratado. Transfira o conjunto da placa para um analisador de fluxo. Dentro do analisador, as sondas do sensor descem para criar uma microcâmara transitória. Para medir o fluxo extracelular, a porta de injeção introduz compostos de teste na microplaca em pontos de tempo predefinidos.
Com base no metabolismo celular, as concentrações de oxigênio disponíveis e prótons liberados na microcâmara flutuam. Dois fluoróforos embutidos na base do cartucho detectam e medem simultaneamente os níveis de oxigênio e prótons, indicativos de respiração mitocondrial e glicólise, respectivamente. No protocolo a seguir, demonstraremos um ensaio de fluxo extracelular para medir a atividade metabólica das células leucêmicas primárias.
- Enquanto isso, para preparar as placas para análise de fluxo extracelular, adicione 12,5 microlitros de solução adesiva celular em cada poço de duas placas analisadoras de fluxo extracelular de 8 poços. Após 20 minutos, aspire o adesivo celular e lave cada poço duas vezes com 200 microlitros de água estéril por lavagem.
Após a segunda lavagem, deixe as placas no capô até que os poços estejam secos e coloque o cartucho do sensor de cabeça para baixo na bancada do laboratório. Separe a placa de utilidade e o cartucho do sensor do analisador de fluxo e encha cada poço da placa de utilidade com 200 microlitros de calibrante e cada fosso ao redor da parte externa dos poços com 400 microlitros de calibrante.
Retorne o cartucho do sensor para a placa de utilidades que agora contém o calibrante e coloque o conjunto do cartucho em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius sem CO2 durante a noite. Em seguida, ligue o analisador de fluxo extracelular e deixe-o aquecer a 37 graus Celsius durante a noite.
Na manhã seguinte, transferir as células do balão para tubos cónicos de 50 mililitros para centrifugação e ressuspender os grânulos em 1 mililitro do meio experimental adequado para a contagem. Ressuspenda as células em 4 vezes 10 às 6 células em 400 microlitros de concentração de meio experimental e adicione 50 microlitros de células nos poços B a G da placa do analisador de fluxo e 180 microlitros do meio experimental nos poços A e H como os poços de controle de fundo.
Após a centrifugação, adicione lenta e cuidadosamente 130 microlitros do meio experimental aos poços B a G e confirme visualmente a aderência estável das células ao fundo de cada poço sob o microscópio. Em seguida, retorne a placa de análise de fluxo para a incubadora umidificada a 37 graus Celsius sem CO2 por 30 minutos.
20 minutos antes do final da incubação, carregue os compostos nas portas injetoras apropriadas do cartucho de acordo com o protocolo experimental, conforme indicado na tabela. Em seguida, configure o programa de análise de fluxo extracelular apropriado. Inicie o programa e substitua a placa calibrante pela placa de ensaio quando solicitado.