Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para o isolamento de medula óssea fresca e inteira dos membros posteriores de camundongos, especificamente para análise por citometria de massa de células da linhagem de neutrófilos. O método foi desenvolvido para facilitar a investigação de defeitos na medula óssea relevantes para distúrbios sanguíneos, como a leucemia.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Hematologia
- Imunologia
- Biologia Celular
Contexto
- A medula óssea é um tecido essencial que contém células-tronco hematopoiéticas responsáveis pela produção de células sanguíneas.
- O isolamento da medula óssea de ossos grandes, como o fêmur e a tíbia, fornece um alto número de células.
- A análise da medula óssea é fundamental para o estudo das populações de células imunológicas e das doenças sanguíneas.
- A citometria de massa permite a análise de alta dimensão das populações celulares, incluindo células da linhagem de neutrófilos.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo reprodutível para a coleta de medula óssea total dos membros posteriores de camundongos.
- Permitir a análise por citometria de massa de células da linhagem de neutrófilos a partir de medula óssea recém-isolada.
- Apoiar pesquisas sobre defeitos da medula óssea associados a distúrbios sanguíneos.
Métodos Utilizados
- Eutanásia de camundongos C57 black-6 com 6 a 10 semanas de idade.
- Sterilização da área cirúrgica com etanol 70%.
- Dissecação para expor e isolar a tíbia e o fêmur das patas traseiras.
- Remoção do tecido muscular para acessar os ossos.
- Colocação dos ossos em PBS frio para preservar a viabilidade celular.
- Preparação de um sistema de tubos de microcentrífuga em dupla camada com um orifício perfurado no tubo interno.
- Centrifugação para extrair a medula óssea para o tubo de coleta.
Resultados Principais
- Isolamento eficiente de medula óssea total do fêmur e da tíbia de camundongo.
- A medula óssea colhida é adequada para aplicações posteriores, como citometria de massa.
- O protocolo mantém condições fisiológicas para preservar a integridade celular.
- Obtém números suficientes de células para análise de linhagem de neutrófilos e outras células hematopoiéticas.
Conclusões
- Este protocolo fornece um método confiável para o isolamento de medula óssea inteira dos membros posteriores de camundongos.
- A abordagem permite o preparo de amostras de alta qualidade para citometria de massa e análises relacionadas.
- É aplicável a estudos que investigam populações de células hematopoéticas e imunes na saúde e na doença.
Qual linhagem e idade de camundongo são recomendadas para este protocolo?
O protocolo utiliza camundongos C57 black-6 com 6 a 10 semanas de idade, que são comumente empregados em estudos imunológicos e hematológicos.
Por que o fêmur e a tíbia são escolhidos para o isolamento da medula óssea?
Esses ossos grandes fornecem um alto rendimento de células da medula óssea, tornando-os ideais para análises posteriores, como citometria de massa.
Como a esterilidade é mantida durante o procedimento?
A área cirúrgica e o camundongo são esterilizados com etanol a 70%, e o procedimento é realizado sobre uma almofada cirúrgica estéril utilizando instrumentos estéreis.
Qual é a finalidade de usar PBS frio durante o isolamento ósseo?
O PBS frio ajuda a manter as condições fisiológicas e preserva a viabilidade celular durante o processo de isolamento.
Como a medula óssea é extraída dos ossos?
Os ossos são colocados em um tubo de microcentrífuga com um orifício na base, inserido dentro de um tubo maior, e centrifugados para forçar a saída da medula óssea, a fim de coletá-la.
Para quais aplicações posteriores a medula óssea isolada é adequada?
A medula óssea colhida é adequada para citometria de massa e outras análises das populações de células hematopoéticas e imunes.
Este protocolo pode ser adaptado para outras linhagens ou idades de camundongos?
Embora otimizado para camundongos C57 black-6 com idade entre 6 e 10 semanas, o protocolo pode ser adaptado para outras linhagens ou idades com ajustes apropriados.