JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 3:57 min • April 30th, 2023
- As células T, uma classe de linfócitos, desempenham um papel ativo no combate à infecção. Juntamente com vários outros tipos de células sanguíneas, as células T imunocompetentes estão presentes no baço e nos gânglios linfáticos de camundongos. Para isolar seletivamente as células T, colha o baço murino e os gânglios linfáticos e macere-os em um filtro de células. Lave o tecido com um meio apropriado para obter uma suspensão de célula única.
Adicione cloreto de amônio e potássio, ou tampão ACK, para lisar os glóbulos vermelhos. Centrifugue para separar as células sanguíneas intactas do lisado. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células num tampão adequado. Trate a suspensão com uma mistura de anticorpos anticamundongos biotinilados para atingir células sanguíneas como granulócitos, células B, células NK e quaisquer eritrócitos restantes. As células T não são direcionadas e, portanto, permanecem não marcadas.
Em seguida, adicione microesferas magnéticas anti-biotina à suspensão. Todas as células marcadas com biotina se ligam às microesferas. Quando mantidas sob a influência de um forte campo magnético, as células marcadas magneticamente aderem à parede do tubo. As células T não marcadas permanecem em suspensão. Colete as células T enriquecidas não ligadas em um novo tubo de coleta. No protocolo a seguir, mostramos o isolamento das células T do baço e linfonodos de camundongos, utilizando uma técnica de separação magnética.
- Agrupe os gânglios linfáticos e o baço em um filtro de poros de 40 micrômetros e use um êmbolo de seringa para macerar os tecidos através dos filtros para liberar as células. Lave o filtro e o êmbolo com meio RPMI suplementado com 1% de FBS para coletar todas as células e sedimentar as células por centrifugação. Adicione 5 mililitros de tampão de lise ACK ao pellet celular.
Após cinco minutos à temperatura ambiente, pare a reação com 5 mililitros de meio suplementado com 1% de FBS e pulverize os glóbulos brancos por centrifugação. Ressuspenda o pellet em 5 mililitros de tampão MACS para contagem e dilua as células a uma concentração de 2 vezes 10 elevado a 8 células por microlitro em tampão MACS fresco. Adicione a concentração apropriada de anticorpos antieritroides, antigranulócitos, anticélulas B e antidepleção de células NK por 1 vezes 10 às 6 células para uma incubação de 15 minutos a 4 graus Celsius.
No final da incubação, lave as células com 10 milímetros de tampão MACS gelado e ressuspenda o pellet em uma concentração de 1 vezes 10 a 8 células por mililitro em tampão MACS fresco. Em seguida, adicione 0,22 microlitros de microesferas anti-biotina por 1 vezes 10 às 6 células com mistura para uma incubação de 15 minutos a 4 graus Celsius.
No final da incubação, lave as células com 10 mililitros de tampão MACS gelado e colete as células T enriquecidas não ligadas por separação magnética de esferas usando o separador expresso MACS de acordo com os protocolos padrão de isolamento de contas. No final da separação, sedimentar as células T por centrifugação e ressuspender o pellet em 5 mililitros de tampão MACS fresco para contagem.