Ensaio de imunoprecipitação de cromatina: uma técnica para estudar interações proteína-DNA em células

- A imunoprecipitação da cromatina, ou ChIP, é uma técnica usada para determinar as interações proteína-DNA nas células. As proteínas se ligam a locais específicos no DNA e regulam a expressão gênica. Primeiro, estabilize o complexo DNA-proteína com formaldeído. O formaldeído liga proteínas à sequência de DNA associada, formando ligações covalentes.

Em seguida, use um tampão de lise adequado para lisar as células para liberar cromatina contendo os complexos DNA-proteína reticulados. Centrifugar a suspensão e sonicar o sobrenadante para obter fragmentos de cromatina. Posteriormente, rotule a amostra com um anticorpo adequado que se liga especificamente à proteína ligada ao DNA.

Adicione esferas magnéticas especializadas à amostra. O cordão reconhece o anticorpo e se liga a ele. Use um ímã para coletar as esferas magnéticas com o complexo anticorpo-proteína-DNA. Lave a amostra para remover a cromatina ou anticorpos não ligados. Adicione um tampão de alta concentração de sal ao complexo e incube em temperaturas mais altas para reverter as ligações cruzadas das proteínas do DNA.

Usando um ímã, colete o sobrenadante contendo o DNA e as proteínas. Adicione a enzima proteinase K para degradar as proteínas na amostra. Adicione um tampão adequado para precipitar o DNA e use-o para análises posteriores. O protocolo a seguir demonstrará a imunoprecipitação da cromatina em células de leucemia linfocítica crônica para identificar genes-alvo NFAT2.

- Primeiro, prepare 20 microlitros de esferas revestidas de proteína A para cada precipitação em um tubo de 1,5 mililitro. Deixe as contas assentarem em um rack magnético por um minuto e remova o sobrenadante. Em seguida, lave as esferas com 40 microlitros de 1x tampão ChIP 1 para cada 20 microlitros de esferas revestidas com proteína A, pipetando para cima e para baixo.

Deixe as contas assentarem em um rack magnético por um minuto e remova o sobrenadante. Repita este processo de lavagem mais três vezes antes de ressuspender as esferas em seu volume original de 1x tampão ChIP 1. Adicione BSA, inibidor de protease, tampão 5x ChIP e água de grau ChIP-seq aos grânulos. Em seguida, adicione a cromatina cortada.

Use 10 microgramas de anticorpo anti-NFAT2 para capturar NFAT2 e 2,5 microgramas de anticorpo IgG como controle. Incube as misturas durante a noite a 4 graus Celsius em uma roda girando a seis RPM. No dia seguinte, gire os tubos por cinco segundos a 7.000 vezes g e incube-os no rack magnético por um minuto.

Em seguida, aspire o sobrenadante e lave os grânulos uma vez com os tampões de lavagem 1, 2, 3 e 4, consecutivamente. Gire os tubos por cinco segundos a 7.000 vezes g antes de incubar os tubos no rack magnético por um minuto. Depois disso, remova o sobrenadante e adicione o próximo tampão de lavagem.

Após a última lavagem, gire os tubos por cinco segundos a 7.000 vezes g. Incube os tubos no rack magnético por um minuto. Remova o sobrenadante e pegue os grânulos em 100 microlitros de tampão de eluição 1. Em seguida, incube os tubos na roda giratória por 30 minutos.

Em seguida, gire brevemente os tubos e coloque-os em um rack magnético por um minuto. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro e adicione 4 microlitros de tampão de eluição 2. Para criar o controle de entrada, misture 1 microlitro da cromatina cisalhada com 99 microlitros de tampão de eluição um e 4 microlitros de tampão de eluição dois. Em seguida, incubar as amostras por quatro horas a 65 graus Celsius com agitação.

Depois disso, adicione 100 microlitros de isopropanol 100% aos tubos. Vortex e gire as amostras por cinco segundos a 7.000 vezes g. Em seguida, adicione 10 microlitros de esferas magnéticas a cada amostra. Vortex e incubar as amostras em uma roda giratória à temperatura ambiente por uma hora.

Em seguida, gire os tubos brevemente e coloque-os em um rack magnético por um minuto. Aspire o sobrenadante e ressuspenda os grânulos em 100 microlitros de tampão de lavagem um. Inverta os tubos para misturá-los e incubá-los por cinco minutos em uma roda giratória em temperatura ambiente. Em seguida, centrifugue brevemente os tubos. Coloque-os em um rack magnético por um minuto e use uma pipeta para remover o sobrenadante.

Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de lavagem dois. Inverta os tubos para misturar e incube-os por cinco minutos em uma roda giratória em temperatura ambiente. Depois disso, centrifugue brevemente os tubos e coloque-os em um rack magnético por um minuto. Remova o tampão de lavagem dois, por aspiração, e ressuspenda os grânulos em 55 microlitros de tampão de eluição.

Para eluir o DNA precipitado, incube as amostras em uma roda giratória à temperatura ambiente por 15 minutos. Depois disso, gire os tubos brevemente e coloque-os em um rack magnético por um minuto. Por fim, transfira o sobrenadante para novos tubos de 1,5 mililitro.