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Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 5:21 min • April 30th, 2023
- A célula-tronco hematopoiética e progenitora ou HSPC, pode se auto-renovar e se diferenciar em vários tipos de células sanguíneas. As HSPCs acumulam gradualmente mutações no DNA durante a vida, o que pode contribuir para a leucemia. Para analisar essas mutações, as HSPCs são geradas geralmente a partir da medula óssea.
Comece adicionando anticorpos conjugados com fluoróforo a células mononucleares - células-tronco adultas isoladas da medula óssea - e incubando-as pela duração desejada. Os anticorpos se ligam a marcadores específicos de superfície celular, como CD34. Agora, carregue a mistura na citometria de células ativada por fluorescência ou na máquina FACS.
Os anticorpos conjugados com fluoróforo fluorescem quando atingidos pelo laser. Gotículas de células individuais passam pelo detector que mede a intensidade da fluorescência, com base na qual a gota possui uma carga elétrica. Na presença de campos eletromagnéticos, as células carregadas positivamente se movem para o recipiente negativo e vice-versa.
Agora, cultive os HSPCs CD34-positivos classificados por FACS em um meio apropriado pela duração desejada até que os clones sejam visíveis. Em seguida, desaloje os clones por pipetagem vigorosa e centrifugue para pellet as células. Armazene o pellet contendo HSPCs clonais a menos 20 graus Celsius para análise posterior. No protocolo a seguir, geraremos clones de HSPC a partir das células mononucleares.
- Comece este procedimento com a preparação do material da amostra e coloração conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, prepare 25 mililitros de meio de cultura de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas, ou HSPC. Encha uma placa de cultura de células de 384 poços com 75 microlitros de meio de cultura HSPC em cada poço. Para evitar a evaporação do meio nos poços externos, encha os poços externos com 75 microlitros de água estéril ou PBS e não use esses poços para classificação de células.
A classificação correta de HSPCs de sinal viáveis é a etapa mais crítica neste protocolo. Defina os portões para a classificação do HSPC com base em um controle não corado em 10.000 células da amostra de coloração. Gate células únicas desenhando uma porta ao redor da altura de dispersão linear para frente versus a fração da área de dispersão para frente.
Use a fração de controle não corada para desenhar uma porta para a fração de linhagem. Desenhe portões para células CD34 positivas e caracterize ainda mais esse subconjunto definindo um portão específico para células CD38 negativas e CD45RA negativas. Carregue a placa de 384 poços na máquina FACS e classifique as células individuais. Se aplicável ao computador FACS, ative a opção de manter os dados de classificação de índice para permitir o rerastreamento das células classificadas.
Para cultivar HSCs classificados individualmente, embrulhe a placa de cultura de 384 poços com tampa em filme de polietileno transparente. Transfira a placa de 384 poços para uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e mantenha-a na incubadora por três a quatro semanas até que apareçam clones visíveis. Após quatro semanas de cultivo, determine quais poços têm uma confluência de 30% ou mais.
Para cada clone, pré-preencha microtubos de 1,5 milímetro com 1 mililitro de 1% de BSA em PBS e rotule o tubo de acordo com o poço correspondente. Umedeça previamente uma ponta de pipeta com 1% de BSA em PBS para minimizar o número de células aderidas à ponta da pipeta. Pipete ferozmente o meio para cima e para baixo pelo menos cinco vezes enquanto raspa o fundo do poço com uma pipeta de 200 microlitros ajustada para 75 microlitros.
Colete a suspensão celular no microtubo rotulado que corresponde ao poço. Repita a pipetagem no poço com até 75 microlitros de BSA e PBS frescos a 1% para garantir a absorção máxima das células. Células cultivadas clonalmente podem grudar no fundo de um poço. Inspecione os poços usando um microscópio de luz invertida padrão para garantir que todas as células foram coletadas.
Se todos os poços com mais de 30% de confluência tiverem sido colhidos, coloque a placa de 384 poços de volta na incubadora. As culturas clonais podem proliferar por até cinco semanas. Gire a suspensão celular por cinco minutos a 350 vezes g. Um pequeno pellet deve estar visível. Remova cuidadosamente tudo, exceto cerca de cinco microlitros do sobrenadante. Os pellets celulares podem ser congelados a menos 20 graus Celsius e armazenados por vários meses antes do isolamento do DNA.