Classificação de células ativadas por magnetismo: um método para isolar células positivas do c-kit

- c-Kit, ou CD117, é um receptor transmembrana de tirosina quinase expresso por células-tronco hematopoiéticas ou progenitoras presentes na medula óssea e no sangue. É também um marcador para detectar leucemia mieloide aguda.

Para isolar as células positivas do c-Kit, colha os ossos murinos da perna e esmague-os para liberar a medula de dentro. Filtre a suspensão da medula para remover quaisquer fragmentos ósseos. Colocar o filtrado contendo células da medula óssea num meio de gradiente de densidade e centrifugar para separar as células mononucleares das outras frações.

Colete a camada turva de células mononucleares em um tubo contendo microesferas conjugadas a anticorpos anti-CD117 de camundongo. Incube para que os complexos anticorpo-grânulos se liguem aos receptores CD117 em células positivas para c-Kit. Passe a suspensão incubada através de uma coluna magnética colocada em um campo magnético. Todas as células positivas do c-Kit marcadas com as microesferas magnéticas permanecem na coluna, enquanto as células não marcadas passam.

Remova a coluna do campo magnético e lave o conteúdo usando um tampão adequado para eluir as células positivas do c-Kit. No protocolo a seguir, mostraremos o isolamento de células positivas do c-Kit da medula óssea de um camundongo transgênico.

- Para começar, colha os ossos da perna de um camundongo sacrificado. Limpe os tecidos dos ossos com um bisturi. Em seguida, coloque os ossos em PBS frio no gelo e esmague os ossos com um pilão. Depois disso, filtre a suspensão celular através de um filtro de célula de 70 micrômetros em um tubo de tampa de rosca de 50 mililitros com uma pipeta de 10 mililitros. Lave o almofariz e o pilão várias vezes com PBS frio e adicione a suspensão celular ao tubo de 50 mililitros.

Em seguida, centrifugue a medula óssea e remova o sobrenadante com vácuo e pipeta de vidro. Ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de PBS. Usando uma pipeta, adicione lentamente a medula óssea suspensa ao topo da polissacarose à temperatura ambiente.

Depois disso, gire a polissacarose a 400 G's por 20 minutos com o freio desligado. Após a cetrifugação, colete a interface de célula mononuclear total turva com uma pipeta e transfira-a para um novo tubo de 15 mililitros. Traga o volume para 10 mililitros com PBS e remova 20 microlitros para contagem.

Após a cetrifugação, rejeitar o sobrenadante e colocar o pellet no gelo. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em PBS com EDTA e BSA. Adicione microesferas CD117 à suspensão celular e ao vórtice para misturar. Depois disso, incube a suspensão por 10 minutos a 4 graus Celsius. Em seguida, aumente o volume para 10 mililitros com mais PBS com EDTA e BSA e centrifugue a 1.200 G's a 4 graus Celsius por cinco minutos.

Use o vácuo para remover o sobrenadante e suspender o pellet celular em PBS com EDTA e BSA. Em seguida, adicione três mililitros de PBS com EDTA e BSA a um suporte magnético com uma coluna magnética e deixe-o fluir para um tubo de coleta. Depois que o buffer terminar de fluir através da coluna, adicione a suspensão da célula e deixe-a fluir através da coluna para o tubo de coleta.

Em seguida, adicione mais 5 mililitros de PBS com EDTA e BSA à coluna e lave-a imediatamente com o êmbolo. Remova o êmbolo e repita a lavagem antes de contar as células. Depois de centrifugar as células, remover o sobrenadante e suspender o sedimento celular em IMDM completo para cultura. Cultive as células durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.