JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 4:59 min • April 30th, 2023
- Retrovírus são vírus de RNA que se replicam usando transcriptase reversa para converter seu genoma de RNA em DNA de fita dupla e se integrar permanentemente ao genoma do hospedeiro. Novas partículas virais saem da célula e podem infectar outras células. A terapia genética do câncer emprega vetores retrovirais para introduzir genes terapêuticos nas células-alvo por meio de uma técnica chamada transdução para regular negativamente o gene mutado ou eliminar células.
Para obter vetores retrovirais de alto título, transfecte as células HEK 293 com uma mistura de transfecção contendo o plasmídeo retroviral desejado, plasmídeo de embalagem e um agente de transfecção adequado. Incube as células. O agente transfectivo facilita a entrega de ambos os plasmídeos nas células.
O plasmídeo retroviral codifica o genoma viral com o gene alvo, enquanto o plasmídeo de embalagem codifica as proteínas do envelope viral. A maquinaria celular das células de empacotamento forma partículas retrovirais e as libera no meio. Colete o sobrenadante viral e centrifugue para remover as células.
Transfira a concentração desejada de partículas virais e células cancerígenas para uma placa de cultura revestida com fibronectina para facilitar a ligação das proteínas do envelope viral às células. Incube as células. Colete as células e realize citometria de fluxo para analisar a eficiência da transdução. Este protocolo realizará a transdução mediada por retrovírus de células da medula óssea de camundongos positivas para c-Kit.
- Primeiro, combine o DNA do plasmídeo retroviral com o plasmídeo de embalagem, cloreto de cálcio e água em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 500 microlitros de HBS a outro tubo de 1,5 mililitro. Adicione a mistura de transfecção gota a gota ao tubo que contém HBS enquanto mistura simultaneamente com o vórtice definido para a configuração mais baixa.
Incube a mistura de transfecção em temperatura ambiente por 20 a 30 minutos. Durante o período de incubação, adicione cloroquina às células HEK e mantenha-as na incubadora. Depois de adicionar a mistura de transfecção, incube as células por 8 horas em uma incubadora de 37 graus Celsius, 5% de CO2, trocando o meio celular adicionando 14 mililitros de meio DMEM 10 fresco muito lentamente. A pipetagem lenta contra a parede do prato ajuda a evitar qualquer remoção das células HEK.
Em seguida, incube as células durante a noite na incubadora de 37 graus Celsius, 5% de CO2. Use uma seringa de 10 mililitros para coletar o sobrenadante viral. Em seguida, conecte um filtro de seringa de 0.45 micrômetro à seringa. Mergulhe o sobrenadante viral em um novo tubo de coleta. Colete o sobrenadante viral aproximadamente 16 horas depois.
Depois disso, adicione 2 mililitros de fragmento de fibronectina humana recombinante em PBS a placas de cultura de 6 poços não tratadas. No dia seguinte, use uma pipeta para remover a fibronectina das placas. Bloqueie as placas com 2% de BSA em PBS e incube as placas em temperatura ambiente por 30 minutos.
Use um aspirador para remover o BSA e lave as placas com PBS antes de removê-lo com o aspirador. Depois disso, adicione imediatamente o sobrenadante viral filtrado e centrifugue a placa por duas horas. Use um vácuo para remover o sobrenadante e gire a placa novamente.
Em seguida, remova o sobrenadante com vácuo e lave os poços revestidos com vírus com PBS. Remova o PBS com o aspirador. Adicione as células de camundongo c-Kit+ previamente cultivadas aos poços revestidos de vírus. Após a centrifugação, incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. 48 horas após a transdução, pulverizar as células por centrifugação e ressuspendê-las no tampão FACS número 1.