JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 3:31 min • April 30th, 2023
- Às vezes, uma célula-tronco ou progenitora sofre mutações, dando origem a uma célula-tronco leucêmica. Nessas células, certas proteínas são reguladas positivamente, e o uso de compostos anticancerígenos contra essas proteínas pode ajudar a controlar o crescimento das células. O efeito desses compostos anticancerígenos pode ser analisado usando o ensaio de UFC, monitorando o número e o tamanho das colônias formadas.
Comece pegando células progenitoras de um camundongo leucêmico e diluindo-as em um meio de cultura adequado. Adicione esta suspensão celular junto com o composto anticancerígeno apropriado à metilcelulose contendo citocinas específicas de camundongos e despeje-a em uma placa de Petri. Incube esta mistura até que as colônias apareçam. A metilcelulose é uma matriz semi-sólida quimicamente inerte que impede a migração celular, enquanto as citocinas estimulam as células progenitoras a se diferenciarem e formarem colônias contendo progênie reconhecível.
Em seguida, core as colônias usando cloreto de iodonitrotetrazólio, ou INT, e incube durante a noite até que as colônias fiquem marrom-avermelhadas escuras. As enzimas mitocondriais reduzem o INT de cor amarela ao corante formazan de cor marrom avermelhada. Por fim, identifique e conte as colônias presentes na placa. No protocolo a seguir, realizaremos um ensaio de UFC para testar o efeito de compostos anticancerígenos em células positivas para YFP.
- Primeiro, descongele a metilcelulose com citocinas para camundongos à temperatura ambiente. Em seguida, alíquota de 3 mililitros de metilcelulose em um tubo FACS. Adicione 100 microlitros da suspensão celular com os inibidores apropriados a 3 mililitros de metilcelulose. Em seguida, bata a suspensão em alta por 10 a 30 segundos.
Depois que a maioria das bolhas de ar escapar, use uma seringa de 1 mililitro para colocar 1 mililitro da mídia em três placas replicadas. Coloque as placas em uma placa de Petri grande junto com uma placa aberta contendo água estéril. Em seguida, cubra a placa de Petri grande e incube as células a 37 graus Celsius.
Prepare a coloração de cloreto de iodonitrotetrazólio dissolvendo 10 miligramas do cloreto de iodonitrotetrazólio em 10 mililitros de água. Filtre esterilize a solução de coloração com uma seringa Luer-Lok equipada com um filtro de 0,2 micrômetro.
Na capa de cultura de tecidos, adicione 100 microlitros da solução de coloração gota a gota ao redor da placa de UFC. Em seguida, incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de células. Finalmente, depois que as colônias ficarem com uma cor marrom-avermelhada escura, use um fundo branco na capa de cultura de tecidos estéreis para tirar fotos da placa de UFC manchada.