Metabolismo de purinas extracelulares: um ensaio baseado em HPLC para medir a geração e o metabolismo de adenosina em células leucêmicas

- A adenosina, um nucleosídeo purina presente em concentrações nominais no espaço extracelular, ajuda a controlar a proliferação celular em condições fisiológicas. Durante condições patológicas como leucemia, a concentração de adenosina extracelular aumenta e inibe as respostas imunes contra células cancerígenas. O acúmulo de adenosina resulta da desfosforilação de nucleotídeos de ATP ou ADP, ou devido à degradação prejudicada da adenosina em nucleosídeo de inosina.

Para medir a geração e o consumo de adenosina, cultive células cancerígenas na presença de um substrato de nucleotídeos. A atividade metabólica da adenosina das células determina as concentrações de várias moléculas de purina presentes na cultura. Centrifugue para remover as células e obter moléculas de purina no sobrenadante.

Para separar e quantificar as purinas, transfira a amostra para frascos apropriados. Carregue-os em uma fase reversa, cromatografia líquida de alta eficiência ou coluna RP-HPLC, contendo uma fase estacionária imobilizada com ligantes hidrofóbicos. Ao passar pela coluna, as moléculas hidrofóbicas adsorvem aos ligantes e são retidas com base em sua hidrofobicidade. As moléculas menos hidrofóbicas fl