Why does denaturing solution prevent RNA degradation in plasma?

The denaturing solution homogenizes the plasma sample and inhibits ribonucleases, protecting miRNA integrity during extraction. This step is critical for recovering intact circulating biomarkers from blood fluids.

How does acid phenol-chloroform separation isolate RNA from plasma?

Acid phenol-chloroform separates plasma into phases, with RNA partitioning into the upper aqueous phase while DNA and proteins remain in the organic phase. This enables selective recovery of RNA for downstream miRNA enrichment.

What role does 25% ethanol play in the filtration step?

At 25% ethanol, large RNAs bind to the filter cartridge while smaller miRNAs pass into the filtrate, enabling size-based fractionation. This initial condition depletes abundant RNA species to improve miRNA recovery.

Why is ethanol concentration increased to 55% for miRNA capture?

Increasing ethanol to 55% promotes binding of small miRNAs to the filter cartridge, allowing their retention while contaminants flow through. This step enriches the miRNA fraction prior to elution.

How does elution buffer recover miRNAs from the filter?

Adding preheated elution buffer to the cartridge and centrifuging releases bound miRNAs into the collection tube. This step yields purified miRNA ready for quantification or downstream analysis.

Extração de miRNA circulante: um método para isolar miRNA de amostras de plasma por meio de extração orgânica e enriquecimento de RNA pequeno

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cancer Research

0 views • 4:33 min • April 30th, 2023

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- MicroRNAs ou miRNAs são pequenos RNAs não codificantes que regulam a expressão gênica degradando o mRNA ou bloqueando sua tradução em proteínas funcionais. Os miRNAs circulantes são potenciais biomarcadores de câncer e podem ser extraídos de fluidos corporais como o plasma. Para começar, misture o plasma com uma solução desnaturante que simultaneamente homogeneíza a amostra e inibe as ribonucleases degradadoras de RNA.

Trate com fenol-clorofórmio ácido e centrifugue para separar a amostra em duas fases, uma fase orgânica inferior contendo DNA e proteínas e uma fase aquosa superior contendo RNA. Recupere a fase aquosa. Adicione etanol absoluto para precipitar o RNA da solução.

Traga a concentração de etanol da amostra para 25% para definir uma condição inicial propícia à grande separação de RNA. Transfira a mistura para um cartucho filtrante pré-montado e centrifugue. Os RNAs grandes imobilizam seletivamente no filtro, enquanto os miRNAs menores se acumulam no filtrado.

Posteriormente, aumentar a concentração de etanol para 55% para favorecer o isolamento de miRNA. Transfira o filtrado para um novo cartucho de filtro e centrifugue para capturar os miRNAs. Coloque o cartucho em um tubo de coleta e adicione um tampão de eluição adequado. Centrifugue para eluir os miRNAs no tubo. No protocolo a seguir, mostraremos o isolamento de miRNA circulante do plasma de pacientes com câncer colorretal.

Para começar, transfira 400 microlitros da amostra de plasma para um tubo de 2 mililitros sem RNase. Em seguida, adicione 400 microlitros de solução desnaturante ao tubo. Adicione 4 microlitros de 1 nanomolar spike-in.

Depois de misturar a solução, adicione 800 microlitros de fenol-clorofórmio ácido. Vortex a solução por 60 segundos e centrifugue na velocidade máxima por 15 minutos. Em seguida, transferir para o lisado contido na fase aquosa superior para um tubo limpo, tomando cuidado para não perturbar a interfase.

Meça o volume da fase aquosa recuperada e adicione 1/3 do volume de etanol ao lisado. Em seguida, coloque um cartucho de filtro em um tubo de coleta novo. Transfira até 700 microlitros da mistura de lisado de etanol para o cartucho do filtro. Centrifugue o cartucho do filtro por 30 segundos a 10.000 x g.

Em seguida, meça o volume total do fluxo. Em seguida, adicione 2/3 do volume de etanol ao filtrado e misture bem. Coloque um segundo cartucho de filtro em um tubo de coleta novo. Em seguida, transfira até 700 microlitros da amostra para o cartucho e centrifugue a 10.000 x g por 30 segundos antes de descartar o fluxo.

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Last updated: 18 July 2026

Extração de miRNA circulante: um método para isolar miRNA de amostras de plasma por meio de extração orgânica e enriquecimento de RNA pequeno

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