Extração de miRNA circulante: um método para isolar miRNA de amostras de plasma por meio de extração orgânica e enriquecimento de RNA pequeno

- MicroRNAs ou miRNAs são pequenos RNAs não codificantes que regulam a expressão gênica degradando o mRNA ou bloqueando sua tradução em proteínas funcionais. Os miRNAs circulantes são potenciais biomarcadores de câncer e podem ser extraídos de fluidos corporais como o plasma. Para começar, misture o plasma com uma solução desnaturante que simultaneamente homogeneíza a amostra e inibe as ribonucleases degradadoras de RNA.

Trate com fenol-clorofórmio ácido e centrifugue para separar a amostra em duas fases, uma fase orgânica inferior contendo DNA e proteínas e uma fase aquosa superior contendo RNA. Recupere a fase aquosa. Adicione etanol absoluto para precipitar o RNA da solução.

Traga a concentração de etanol da amostra para 25% para definir uma condição inicial propícia à grande separação de RNA. Transfira a mistura para um cartucho filtrante pré-montado e centrifugue. Os RNAs grandes imobilizam seletivamente no filtro, enquanto os miRNAs menores se acumulam no filtrado.

Posteriormente, aumentar a concentração de etanol para 55% para favorecer o isolamento de miRNA. Transfira o filtrado para um novo cartucho de filtro e centrifugue para capturar os miRNAs. Coloque o cartucho em um tubo de coleta e adicione um tampão de eluição adequado. Centrifugue para eluir os miRNAs no tubo. No protocolo a seguir, mostraremos o isolamento de miRNA circulante do plasma de pacientes com câncer colorretal.

Para começar, transfira 400 microlitros da amostra de plasma para um tubo de 2 mililitros sem RNase. Em seguida, adicione 400 microlitros de solução desnaturante ao tubo. Adicione 4 microlitros de 1 nanomolar spike-in.

Depois de misturar a solução, adicione 800 microlitros de fenol-clorofórmio ácido. Vortex a solução por 60 segundos e centrifugue na velocidade máxima por 15 minutos. Em seguida, transferir para o lisado contido na fase aquosa superior para um tubo limpo, tomando cuidado para não perturbar a interfase.

Meça o volume da fase aquosa recuperada e adicione 1/3 do volume de etanol ao lisado. Em seguida, coloque um cartucho de filtro em um tubo de coleta novo. Transfira até 700 microlitros da mistura de lisado de etanol para o cartucho do filtro. Centrifugue o cartucho do filtro por 30 segundos a 10.000 x g.

Em seguida, meça o volume total do fluxo. Em seguida, adicione 2/3 do volume de etanol ao filtrado e misture bem. Coloque um segundo cartucho de filtro em um tubo de coleta novo. Em seguida, transfira até 700 microlitros da amostra para o cartucho e centrifugue a 10.000 x g por 30 segundos antes de descartar o fluxo.

Adicione 700 microlitros de solução de lavagem de microRNA ao cartucho do filtro e centrifugue-o com um tubo de coleta a 10.000 x g por 15 segundos. Descarte o fluxo e coloque o cartucho do filtro de volta no mesmo tubo.

Depois disso, mova o cartucho do filtro para um novo tubo de coleta. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de eluição pré-aquecida ao cartucho. Centrifugue o cartucho do filtro a 10.000 x g por 30 segundos para recuperar os microRNAs.

• MicroRNAs - Small non-coding RNAs that regulate gene expression.
• Circulating miRNAs - miRNAs in body fluids used as possible cancer biomarkers.
• Denaturing Solution - Homogenizes the sample and inhibits RNA-degrading ribonucleases.
• Acid phenol-chloroform - Used to separate the sample into distinct phases.
• Elution Buffer - A solution added to elute miRNAs into a collection tube.

• Introduce MicroRNAs - Small molecules regulating gene expression (e.g., mirna).
• Key Concepts – Summarize the roles and potential of miRNAs in cancer research (e.g., mirna plasma kit).
• Underlying Mechanisms – miRNAs are isolated using specific procedures (e.g., mirvana isolation kit).
• Connect to Experiment – The study utilizes miRNA isolation from plasma samples.

• What are MicroRNAs and how to extract them (using mirna extraction kits)?
• How does the process of miRNA isolation work (using mirvana paris kit)?
• What is the role of circulating miRNAs in cancer research?

• Practical Applications – miRNAs in diagnostics, research, and treatment (e.g., micro rna isolation).
• Industry Impact – Impacting biotech, healthcare sectors (e.g., s1122-1830).
• Societal Importance – Potential benefits in early disease detection (e.g., miRNA isolation protocol).
• Link to Scientific Advancements – Emergence of advanced extraction kits (e.g., mirna plasma extraction kit).