PCR digital para quantificar circulando MicroRNAs no infarto agudo do miocárdio e doença Cardiovascular
3 de julho de 2018
MicroRNAs circulantes têm mostrado promessa como biomarcadores para doenças cardiovasculares e aguda do miocárdio. Neste estudo, descrevemos um protocolo para extração de miRNA, a transcrição reversa e PCR digital para a quantificação absoluta dos miRNAs no soro de pacientes com doença cardiovascular.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do diagnóstico, como se os micro RNAs são biomarcadores válidos em doenças cardiovasculares. Em comparação com a PCR quantitativa em tempo real, a PCR digital exibe qualidades técnicas superiores para quantificar microRNAs na circulação. Como a amostra é dividida em cerca de 20.000 gotículas, nenhuma medição duplicada é necessária e nenhuma curva padrão é necessária para quantificação.
Embora este método possa fornecer informações sobre a quantificação de microRNAs em pacientes cardiovasculares, ele também pode ser aplicado a outros pacientes e doenças, pois outros microRNAs têm se mostrado promissores como biomarcadores na progressão do câncer, também pode ser aplicado a pacientes oncológicos. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades porque as gotículas geradas são frágeis e precisam ser manuseadas com cuidado. Depois de isolar o RNA das amostras de soro, continue com a transcrição reversa para obter DNA complementar mais estável para dPCR.
Para começar, descongele o kit de transcrição reversa no gelo. Em seguida, gire as enzimas e os primers para baixo. Em seguida, prepare a mistura master conforme descrito no protocolo de texto.
Combine 10 microlitros da mistura principal com cinco microlitros de RNA extraído em cada poço de uma placa de 96 poços. Em seguida, centrifugue a placa a 2.000xg a quatro graus Celsius por dois minutos. Prossiga com a transcrição reversa conforme detalhado no protocolo de texto.
Primeiro, descongele a mistura comercial de dPCR, cDNA e primers de PCR em gelo e centrifugue imediatamente antes do uso. Em seguida, prepare a mistura principal conforme descrito no protocolo de texto. Adicione volumes de 1,33 microlitros de produto de transcrição reversa a volumes de 18,67 microlitros da mistura master e centrifugue brevemente.
Usando uma pipeta, transfira 20 microlitros da amostra para cada poço da fileira média de um de oito poços. Em seguida, pipete 70 microlitros de óleo de geração de gotículas nos poços de óleo do. Em seguida, coloque uma junta em cima do e coloque-a no gerador de gotículas.
Feche o gerador de gotículas e espere até que as três luzes indicadoras fiquem verdes sólidas. Usando uma pipeta, transfira cuidadosamente 40 microlitros da amostra formada por gotículas para poços separados de uma placa de 96 poços. Em seguida, sele a placa com papel alumínio dPCR a 180 graus Celsius por quatro segundos.
Coloque a placa PCR selada no ciclador e siga as instruções de ciclagem descritas no protocolo de texto. Remova a placa do termociclador e transfira-a para a base de um suporte de placa. Em seguida, coloque a parte superior do suporte da placa na placa PCR.
Por fim, inicie o software dPCR comercial. Nesse protocolo, a PCR digital foi utilizada para quantificar microRNAs no soro de pacientes com doença cardiovascular. As amostras foram coletadas de 16 pacientes antes, oito horas após e 16 horas após a intervenção percutânea.
Pacientes com infarto do miocárdio com supradesnivelamento do segmento ST apresentaram um aumento significativo nos níveis de miR-499 em comparação com pacientes com doença arterial coronariana estável. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de uma hora para a formação de gotículas de 96 amostras, se for feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante ter em mente manusear as gotículas com cuidado.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como realizar a PCR digital corretamente, corrigindo a formação, ciclagem, leitura e análise de gotículas.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para a extração e quantificação de microRNAs circulantes como possíveis biomarcadores para doenças cardiovasculares. Ao utilizar PCR digital, o método tem como objetivo aumentar a precisão da medição de miRNA em amostras de soro de pacientes com condições cardiovasculares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Doença cardiovascular
- Biomarcadores
- Análise de microRNA
Antecedentes
- Os microRNAs são pequenos RNAs não codificantes envolvidos na regulação gênica.
- Eles surgiram como biomarcadores potenciais para diversas doenças, incluindo condições cardiovasculares.
- A PCR digital oferece vantagens em comparação com métodos tradicionais para a quantificação de microRNAs.
- Compreender os perfis de miRNA pode auxiliar no diagnóstico e manejo de doenças cardiovasculares.
Objetivo do Estudo
- Validar microRNAs como biomarcadores para doenças cardiovasculares.
- Demonstrar a eficácia da PCR digital na quantificação de miRNAs circulantes.
- Fornecer um protocolo confiável para pesquisadores da área.
Métodos Utilizados
- Extração de miRNAs de amostras de soro.
- Transcrição reversa para síntese de DNA complementar.
- PCR digital para quantificação absoluta de miRNAs.
- Comparação entre PCR digital e PCR quantitativo em tempo real.
Resultados Principais
- A PCR digital demonstrou precisão superior na quantificação de miRNA.
- O método permite a análise de milhares de gotículas sem a necessidade de curvas-padrão.
- A aplicabilidade potencial do método estende-se além das doenças cardiovasculares para outras condições, como o câncer.
- Foram observados desafios no manuseio de gotículas frágeis por usuários novos na técnica.
Conclusões
- O estudo apoia o uso de microRNAs circulantes como biomarcadores para doenças cardiovasculares.
- A PCR digital é uma ferramenta promissora para a quantificação precisa de miRNAs.
- Pesquisas futuras poderiam expandir a aplicação deste método para outras doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação de microRNAs circulantes com PCR digital fornece uma abordagem reprodutível e de alta sensibilidade para a validação de biomarcadores na pesquisa de doenças cardiovasculares. Este método auxilia na validação de alvos e no desenvolvimento de ensaios ao permitir a quantificação absoluta sem curvas padrão, reduzindo a variabilidade em estudos multicêntricos. A técnica aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta, associando a expressão de miRNA à patologia, orientando decisões de prosseguir/interromper na investigação de hipóteses terapêuticas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação de miRNAs específicos da doença, como o miR-499 na IAM.
- Valor Operacional: Fornece números absolutos de cópias de miRNA sem curvas-padrão, melhorando a reprodutibilidade entre diferentes locais.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem orientada por biomarcadores no portfólio ao associar níveis de miRNA à patologia cardiovascular.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera sistemas biológicos validados (cDNA a partir de RNA sérico) para fluxos de trabalho de triagem downstream.
- Valor Operacional: Fornece resultados com alta linearidade e baixa variabilidade, adequados para padronização de ensaios.
- Escalabilidade: Permite o processamento de 96 amostras em aproximadamente uma hora após o domínio do procedimento, apoiando triagem de média escala.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a quantificação de miRNAs na fase de descoberta à validação pré-clínica por meio de biomarcadores relevantes em soro.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Reduz a ambiguidade na validação de alvos ao correlacionar a expressão de miRNAs com lesão cardiovascular.
- Alinhamento de Biomarcadores: Apoia o desenvolvimento de biomarcadores translacionais mediante a quantificação de miRNAs com alta especificidade tecidual e da doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta que vai do teste de hipóteses à identificação de compostos ativos, fornecendo dados quantitativos de miARN que informam a confiança no alvo e a preparação do ensaio.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a quantificação da liberação de miRNAs por células cardiovasculares na circulação.
- Triagem: Gera saídas padronizadas e prontas para ensaio, com alta sensibilidade, para avaliação de candidatos a biomarcadores.
- Análise: Permite comparação direta dos níveis de miRNA entre diferentes condições, utilizando quantificação absoluta sem curvas-padrão.
- Pesquisa Translacional: Promove a continuidade de biomarcadores ao associar perfis de miRNAs circulantes à patologia cardiovascular.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de quantificação reutilizável, aplicável em indicações cardiovasculares e oncológicas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validade do biomarcador por meio da quantificação de miRNA com baixa variabilidade e alta sensibilidade.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade e padronização por meio do fracionamento baseado em gotas, eliminando medições duplicadas.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas relações entre biomarcadores e alvos.
- Impacto no Portfólio: Permite o avanço ajustado ao risco por meio de dados quantitativos de miRNA vinculados à patologia.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em isolamento de RNA, transcrição reversa e manipulação de gotículas para evitar perda de amostra.
- Necessita de equipamentos para geração de gotículas, termocicladores para PCR e software de dPCR para quantificação precisa.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de formação e selamento de gotículas para resultados reprodutíveis.
- Envolve considerações de adaptação ao ser aplicado a diferentes tipos de amostras além de soro, como plasma ou lisados teciduais.
- Inclui limitações práticas, como a manipulação delicada de gotículas, o que pode afetar o rendimento para usuários inexperientes.
