Name: PCR digital para quantificar circulando MicroRNAs no infarto agudo do miocárdio e doença Cardiovascular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Aprenda a usar PCR digital para quantificar microRNAs circulantes em amostras de soro de pacientes com doenças cardiovasculares. Este método oferece maior precisão sem necessidade de curvas padrão.

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Os autores têm sem confirmações.

1. extração de miRNA de Plasma/soro
Nota: A fim de quantificar os miRNAs apropriadamente, o microRNA correto isolamento do plasma/soro é um passo crucial. Uma chave para manter em mente, especialmente porque existem diferentes protocolos, é aderir ao mesmo fluxo de trabalho durante o processamento das amostras. Neste protocolo, miRNA é extraído de 50 µ l de soro. Não utilize mais de 200 µ l como este limite, o processo de extração correta.
<ol><li>Preparar o soro ou descongelar as amostras congeladas.</li>
	<li>Adicione 50 µ l de soro reagente de Lise comercial 250 µ l (5 volumes). Suporte a Lise vortexing. Coloca o tubo com o lisado no banco na temperatura ambiente por 5 min.</li>
	<li>Spike o lisado com 3,5 µ l de pico-no controle (1.6 x 107 cópias / µ l) e misturá-los vortexing.</li>
	<li>Adicione 50 µ l de clorofórmio (ou seja, uma quantidade igual quanto a amostra de soro inicial) para a separação de fases. Agite o tubo vigorosamente por 15 s. lugar o tubo no banco na temperatura ambiente por 2-3 min.</li>
	<li>Para a separação de fases, centrifugar o tubo a 12.000 x g a 4 ° C por 15 min. Nota: As amostras são separadas agora em uma fase aquosa superior contendo o RNA, uma interfase branco e uma fase orgânica inferior, rosa.</li>
	<li>Transferi a fase aquosa superior (100 µ l), contendo o RNA em um tubo de novo. Não transfira qualquer material branco interfase como este falsifica a contagem correta do RNA.</li>
	<li>Adicione 150 µ l (isto é, 1,5 x o volume da amostra transferido) de 100% de etanol. Misture os materiais pipetando-los acima e para baixo. Não centrifugue-los e passar rapidamente para a próxima etapa.</li>
	<li>Pipete 250 µ l da amostra para uma coluna de rotação comercial em um tubo de coleta de 2 mL. Feche a tampa. Centrifugue a coluna no > 8.000 x g em temperatura ambiente por 15 s. descarte o escoamento.</li>
	<li>Adicione 700 µ l de número de tampão de lavagem comercial 1 para a coluna de rotação. Feche a tampa e centrifugar a coluna no > 8.000 x g em temperatura ambiente por 15 s. descartar o buffer de lavar roupa de ensaio.</li>
	<li>Adicione 500 µ l do número de tampão de lavagem comercial 2 à coluna de rotação. Feche a tampa e centrifugar a coluna no > 8, 000 x g em temperatura ambiente por 15 s. descartar o buffer de lavar roupa de ensaio.</li>
	<li>Pipete 500 µ l de etanol 80% para a coluna de rotação. Feche a tampa, centrifugar a coluna no > 8, 000 x g em temperatura ambiente por 2 min. deite fora o tubo de coleta com o escoamento.</li>
	<li>Transferi a coluna de rotação para um novo tubo de coleta de 2 mL. Centrifugue a coluna em velocidade máxima com uma tampa aberta para secar a membrana. Descarte o tubo de coleta com o escoamento.</li>
	<li>Transferi a coluna de rotação para um novo tubo de coleta de 1,5 mL. Eluir o RNA aplicando 30 µ l de água livre de RNase diretamente para o centro da membrana. Feche a tampa. Centrifugue a coluna a toda a velocidade para 1 min.</li>
	<li>Armazenar o RNA a-70 ° C. Nota: O armazenamento de RNA purificado em água livre de RNase entre-70 ° C a-20 ° C não garante nenhuma degradação do RNA por 1 ano. Seguindo o protocolo do fabricante, a quantidade mínima de água livre de RNase para diluir o RNA é 10 µ l. usando menos do que 10 µ l insuficientemente pode hidratar a membrana e reduzir o rendimento total do RNA.</li>
</ol>2. inverter a transcrição
Nota: O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado utilizando o seguinte protocolo de transcrição reversa (RT) de 15 µ l (volume de reação total).
<ol><li>Descongele o kit RT no gelo. Manter as enzimas no freezer tanto quanto possível para impedir a degradação e girá-los para baixo antes de usar. Descongelar as primeiras demão RT no gelo e girá-los para baixo antes de usar.</li>
	<li>Prepare a mistura de mestre, conforme descrito na tabela 1.</li>
	<li>Combine 10 µ l de mistura de mestre e 5 µ l de RNA extraído por alvéolo em uma placa-96.</li>
	<li>Centrifugue a placa bem a 2.000 x g a 4 ° C por 2 min.</li>
	<li>Use o protocolo de ciclo térmico descrito na tabela 2 para a transcrição reversa. Nota: Conforme descrito abaixo, cDNA pode diretamente ser processado na máquina de PCR digital (ver Tabela de materiais); Alternativamente, ele pode ser armazenado a-20 ° C.</li>
</ol>3. gota geração e PCR Digital
Nota: Digital PCR foi realizado utilizando o seguinte protocolo de 40 µ l.
<ol><li>Descongele o mix comercial dPCR, o cDNA preparado e os primers PCR no gelo. Centrifugá-los logo antes do uso.</li>
	<li>Preparar a mistura de mestre, conforme descrito no tabela 3.
</li>
	<li>Adicionar 1,33 μL/poço do produto RT e centrifugá-lo brevemente.</li>
	<li>Pipete 20 μL da amostra para cada poço da fita 8 poços (linha média). Nota: Se a fita de 8 poços não estiver completamente cheio, encher os poços restantes com controles não-modelo (NTCs) que omitem cDNA (isto é, o produto RT produzido com água em vez de RNA extraído) ou dPCR comercial buffer. A NTC serve como um controle de contaminação. Água não deve ser usada em poços restantes, porque isso vai prejudicar a qualidade da formação da gota.</li>
	<li>Pipete 70 μL do óleo gota geração para as sondas para os poços de petróleo (linha inferior) da fita 8 poços.</li>
	<li>Colocar uma junta em cima da gaveta de 8 poços e coloque a fita no gerador da gota. Feche o gerador da gota. Espere até que as luzes de 3 indicador verde sólido. Nota: As gotas agora estão sendo geradas.</li>
	<li>Lentamente e com cuidado transferi 40 μL da amostra da gota-formado (linha superior) em separado poços de uma placa de 96 poços, pipetando.</li>
	<li>Depois de completar a formação de gotículas nas amostras, selar a placa PCR com uma folha de dPCR perfurável a 180 ° C por 4 s.</li>
	<li>Coloque a folha-selado do PCR-placa no cycler e ciclo-lo conforme descrito na tabela 4, a uma taxa de rampa de 2.5 ° C/s.</li>
</ol>4. gota leitura e análise
<ol><li>Transferi a placa do termociclador à base do titular da chapa. Aperte a placa do PCR, colocando a parte superior do porta-placa na chapa de PCR.</li>
	<li>Inicie o software comercial dPCR.</li>
	<li>Digite o nome da amostra, o nome do experimento e o alvo no setup. Selecione a quantificação absoluta.</li>
	<li>Começa a gota lendo clicando em executar. Selecione FAM/HEX ou FAM/VIC como química de deteção ao trabalhar com sondas de hidrólise. Nota: O software comercial dPCR autoanalisará os dados.</li>
	<li>Verifique os números de gotículas na tabela de resultados para garantir uma geração de gotículas correto.</li>
	<li>Selecione todos os poços com a mesma miRNA quantificado e clique em analisar. Use o blot 2D para marcar gotículas positivas e corrigir manualmente os dados de autoanálise (Figura 1).</li>
</ol>5. corrigir os cálculos sobre a amostra
<ol><li>Normalize a amostra multiplicando o fator de normalização (NF) da amostra. NF = mediana [c. elegans medições de miR-39]todas as amostras/ [c. elegans miR-39]determinada amostra
</li>
	<li>Calcule a concentração de soro de miRNA final, ajuste para fatores de diluição (DF). [miRNA] final = [miRNA]valor bruto x DFRT x DFdPCR x DFEx Onde: [miRNA] valor bruto = o miRNA quantificada pelo software dPCR comercial; DFRT = factor de diluição do modelo na transcrição reversa; DFdPCR = factor de diluição do modelo em dPCR; DF,Ex = factor de diluição na extração.</li>
</ol>6. série de diluição do Oligonucleotide sintético
<ol><li>Descongele o liofilizado do oligonucleotide sintético no gelo. Brevemente, centrifugar.</li>
	<li>Diluir o oligonucleotide sintético liofilizado em água nuclease livre para uma concentração final de 10 pmol / µ l. resumidamente, centrifugar.</li>
	<li>Diluí-la em água livre de nuclease, conforme descrito na tabela 5. Centrifugue a diluição brevemente entre cada etapa de diluição a 8.000 x g por 10 s.</li>
	<li>Continuar com a transcrição reversa, conforme descrito na etapa 2 e análise das amostras com PCR digital conforme descrito nas etapas 3 e 4.</li>
</ol>

<ol><li>Schulte, C., Zeller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-based+diagnostics+and+therapy+in+cardiovascular+disease+-+summing+up+the+facts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Diagnosis+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts.</a> Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).</li>
<li>Sun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microRNAs+in+myocardial+infarction%3A+from+molecular+mechanism+to+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).</li>
<li>Dimmeler, S., Zeiher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+for+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases.</a> European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Oerlemans, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+assessment+of+acute+coronary+syndromes+in+the+emergency+department%3A+the+potential+diagnostic+value+of+circulating+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).</li>
<li>Olivieri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+potential+of+circulating+miR-499-5p+in+elderly+patients+with+acute+non+ST-elevation+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction.</a> Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).</li>
<li>Navickas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+circulating+microRNAs+as+biomarkers+of+cardiovascular+disease%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review.</a> Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).</li>
<li>Devaux, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+value+of+circulating+microRNAs+in+patients+with+acute+chest+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain.</a> Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).</li>
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<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).</li>
<li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+as+a+novel+detection+method+for+quantifying+microRNAs+in+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction.</a> Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).</li>
<li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).</li>
<li>D'Alessandra, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+are+new+and+sensitive+biomarkers+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).</li>
<li>Forootan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+limit+of+detection+and+limit+of+quantification+in+quantitative+real-time+PCR+%28qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR).</a> Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).</li>
<li>Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+droplet-digital+PCR+vs+real-time+quantitative+PCR+to+inhibitory+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances.</a> Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409(2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Digital PCR é um método relativamente novo de ponto de extremidade do PCR que permite a quantificação absoluta direta de ácidos nucleicos dentro de uma amostra. O método possui vantagens específicas, incluindo uma diminuição da variabilidade, uma maior reprodutibilidade diária e uma sensibilidade superior11,12. Além disso, devido o particionamento da amostra em aproximadamente 20.000 reações simples e análises de ponto de extremidade, dPCR é mais robusta para sub...

MiRNAs circulantes foram identificados como marcadores promissoras para uma série de doenças, incluindo doenças cardiovasculares1. Os miRNAs são pequenos, não-codificantes single-stranded RNA moléculas (aproximadamente 22 nucleotides longas) são envolvidas no Regulamento pós-transcricional através da alteração da tradução do RNA mensageiro e influenciando da expressão do gene2, e são liberados na circulação em Estados fisiológicos e patológicos. A expressão quantitativa dos miRNAs específicos pode ser vinculada a patologia, e alguns miRNAs mostram tecido alto e especificidade de doença1. Em doenças cardiovasculares, os miRNAs tornaram-se candidatos atraentes como biomarcadores novela porque são notavelmente estáveis no soro e pode facilmente ser quantificada com a ajuda da metodologia PCR3. O valor potencial dos miRNAs como biomarcadores para infarto do miocárdio foi avaliado em estudos pequenos, mas uma validação em grandes coortes está faltando2. Por exemplo, miR-499 encontra-se altamente expressa no músculo do miocárdio, e isso foi mostrado para aumentar significativamente em um AMI4,5,6. Além disso, regula programada morte celular (apoptose) e a diferenciação dos cardiomyocytes e, portanto, está envolvida em vários mecanismos seguindo um AMI7. Além de alguns pequenos estudos relatando uma superioridade e valor incremental de miRNAs para o diagnóstico da AMI, a superioridade ou igualdade de alta sensibilidade cardíacas troponinas não ainda foi comprovada em estudos em grande escala2,5 ,6,8. Mais estudos prospectivos de coortes grandes são, portanto, necessários para avaliar o valor potencial de diagnóstico dos miRNAs. Além disso, métodos de quantificação de miRNA precisam ser otimizadas e padronizado usando comparáveis protocolos9. Ensaios padronizados podem reduzir resultados inconsistentes e podem ajudar os miRNAs tornar-se potenciais biomarcadores para a aplicação clínica de rotina, como biomarcadores precisam ser quantificado de forma reprodutível para garantir sua aplicabilidade clínica.
Recentemente, dPCR foi introduzido como uma análise de ponto de extremidade. Ele particiona a amostra em aproximadamente 20.000 reações individuais10. O sistema dPCR então utiliza uma matemático Poisson análise estatística de sinais fluorescentes (reações positivas e negativas), permitindo uma quantificação absoluta sem uma curva padrão de10. Ao combinar dPCR com sondas fluorescentes de hidrólise, a quantificação absoluta direta altamente específica de miRNAs é tornada possível. Reação em cadeia da polimerase digital tem demonstrado que exibem qualidades técnicas superiores (incluindo uma diminuição da variabilidade, uma maior reprodutibilidade do dia a dia, um alto grau de linearidade e uma sensibilidade elevada) para quantificação dos níveis de miRNA na circulação comparada a PCR em tempo real quantitativa10,11. Estas qualidades técnicas superiores podem ajudar a atenuar as limitações atuais sobre o uso de miRNAs circulantes como biomarcadores e podem levar ao estabelecimento de miRNAs como biomarcadores em grandes multi centro de ensaios clínicos cardiovasculares e como um método de diagnóstico em geral. Em um estudo anterior, recentemente aplicada dPCR para a quantificação absoluta de miRNAs em pacientes com um AMI em circulação e foram capazes de demonstrar o potencial de diagnóstico superior em comparação com a quantificação dos miRNAs por qPCR12.
Nesta publicação, queremos demonstrar que o uso dPCR é um método exacto e reprodutível para quantificar diretamente a circulação cardiovasculares miRNAs. A quantificação absoluta de miRNA níveis no soro, utilizando PCR digital, mostra o potencial para o uso em grandes multi centro ensaios clínicos cardiovasculares. Nesta publicação, descrevemos em detalhe como efetivamente realizar PCR digital e como detectar o número de cópia de miRNA absoluto, no soro.

<table><tbody><tr><td>RNA-Extraction</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Kit (50)</td><td>Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland</td><td>217184</td><td>Kit para extração de microRNA. O kit contém buffer comercial RWT (chamado de número um no manuscrito)&nbsp; e RPE (chamado de número dois no manuscrito).</td></tr><tr><td>miRNeasy Sérum/Plasma Spike-in-Control; miRNA Syn-cel-miR-39; 10pmol</td><td>Qiagen-Amostra & Assay Technologies, Hilden, Deutschland</td><td>219610</td><td>Spike-in para normalização, Sequência: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'</td></tr><tr><td>Transcrição ReversaKit de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Transcrição Reversa de MicroRNA TaqMan (1000 Reações)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA</td> Kit <td>4366597</td><td>para transcrição reversa de microRNA</td></tr><tr><td>Ensaios de MicroRNA TaqMan M</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA</td><td>4440887</td><td>Ensaios usados na transcrição reversa</td></tr><tr><td>has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA</td> Número <td>do</td><td>ensaio 4440887</td></tr><tr><td>001352 cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA</td><td>Número do ensaio 4440887</td><td>000200</td></tr><tr><td>Placa PCR, 96 poços, segmentado, semi-contornado</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>AB0900</td><td>Placa de 96 poços para transcrição reversa</td></tr><tr><td>Microseal ' B&rsquo; selos</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA</td><td>MSB1001</td><td>Folha para garantir o armazenamento adequado</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1851196</td><td>Cycler usado para transcrição reversa</td></tr><tr><td>Droplet Digital PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 nmole RNA oligo has-miR-499-5p</td><td>Integrated DNA</td><td>Technologies Custom</td><td>Sequência: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'ddPCR</td></tr> <tr><td>Supermix para Sondas (Sem dUTP)</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA</td><td></td><td>1863024 Supermix usado na geração de gotículas</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA</td><td>4440887</td><td>Ensaios usados em PCR digital (sonda de hidrólise fluorescente)</td></tr><tr><td>has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA</td><td>Número 4440887</td><td>do ensaio 001352, primers comerciais</td></tr><tr><td>cel-miR-39 (750 RT / 750 PCR rxns)</td> <td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA</td><td>4440887</td><td>Número do ensaio 000200, primers comerciais</td></tr><tr><td>Cartuchos e juntas DG8 Bio-Rad</td><td>Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA</td><td>1864007</td><td>O cartucho coleta até 8 amostras para geração de gotículas</td></tr><tr><td>Cartucho DG8 Holder</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863051</td><td>Contém cartuchos na geração de gotículas</td></tr><tr><td>Óleo de geração de gotículas para sondas</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA</td><td>1863005</td><td>Óleo usado na geração de gotículas</td></tr><tr><td>Placas de 96 poços ddPCR</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA</td><td>12001925 Placa de</td><td>96 poços para ddPCR</td></tr><tr><td>PCR Placa de vedação térmica, folha, perfurável</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA</td><td>1814040</td><td>Folha perfurável, compatível com leitor de gotículas</td></tr><tr><td>ddPCR Óleo de leitor de gotículas</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA</td><td>1863004</td><td>Óleo usado na leitura de gotículas</td></tr><tr><td>Gerador de gotículas QX100 ou QX200</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA</td><td>1863002</td><td>Gerador de gotículas, gera as gotículas da emulsão de amostra/óleo</td></tr><tr><td>PX1 PCR Seladora de placas</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA</td><td>1814000</td><td>Sela a placa antes do PCR</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1851196</td><td>Cycler usado para ddPCR</td></tr><tr><td>QX100 ou QX200 Leitor de gotículas</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA</td><td>1863003</td><td>Lê gotículas positivas e negativas para PCR com um detector óptico</td></tr><tr><td>Controle de tampão ddPCR para sondas</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA</td><td>1863052</td><td>Controle em branco&nbsp; e para encher os poços restantes de de 8 poços</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantaSof Software</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA</td><td></td><td>1864011 Programa para leitura de gotículas</td></tr><tr><td>Prism Windows 5</td><td>GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA</td><td></td><td>Programa para análise estatística</td></tr></tbody></table>

pcr digital para quantificar circulando micrornas no infarto agudo do miocárdio e doença cardiovascular

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulação soro microRNAs (miRNAs) mostraram a promessa como biomarcadores para a doença cardiovascular e infarto agudo do miocárdio (iam), sendo liberada a partir das células cardiovasculares para a circulação. Os miRNAs circulantes são altamente estáveis e pode ser quantificados. A expressão quantitativa dos miRNAs específicos pode ser vinculada a patologia e alguns miRNAs mostrar tecido alta e especificidade da doença. Encontrar novos biomarcadores para doenças cardiovasculares é de importância para a pesquisa médica. Muito recentemente, reação em cadeia da polimerase digital (dPCR) foi inventada. dPCR, combinado com sondas fluorescentes de hidrólise, permite uma quantificação absoluta direta específica. dPCR exibe qualidades técnicas superiores, incluindo uma baixa variabilidade, alta linearidade e alta sensibilidade em comparação com a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR). Assim, dPCR é um método mais preciso e reprodutível para quantificar diretamente os miRNAs, particularmente para o uso em grandes multi centro de ensaios clínicos cardiovasculares. Nesta publicação, descrevemos como efetivamente realizar PCR digital a fim de avaliar o número de cópia absoluta em amostras de soro.

PCR digital combinado com sondas fluorescentes hidrólise permite que os pesquisadores quantificar diretamente a quantidade absoluta de miRNAs específicos em cópias / µ l. Como a amostra em dPCR é particionada em aproximadamente 20.000 individuais reações de PCR, dPCR não requer técnica Replica10. O sistema dPCR utiliza uma análise estatística matemática de Poisson de sinais fluorescentes (diferindo entre reações positivas e negativas) permitindo uma quantificação a...

MicroRNAs circulantes têm mostrado promessa como biomarcadores para doenças cardiovasculares e aguda do miocárdio. Neste estudo, descrevemos um protocolo para extração de miRNA, a transcrição reversa e PCR digital para a quantificação absoluta dos miRNAs no soro de pacientes com doença cardiovascular.

PCR digital para quantificar circulando MicroRNAs no infarto agudo do miocárdio e doença Cardiovascular

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do diagnóstico, como se os micro RNAs são biomarcadores válidos em doenças cardiovasculares. Em comparação com a PCR quantitativa em tempo real, a PCR digital exibe qualidades técnicas superiores para quantificar microRNAs na circulação. Como a amostra é dividida em cerca de 20.000 gotículas, nenhuma medição duplicada é necessária e nenhuma curva padrão é necessária para quantificação.Embora este método possa fornecer informações sobre a quantificação de microRNAs em pacientes cardiovasculares, ele também pode ser aplicado a outros pacientes e doenças, pois outros microRNAs têm se mostrado promissores como biomarcadores na progressão do câncer, também pode ser aplicado a pacientes oncológicos. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades porque as gotículas geradas são frágeis e precisam ser manuseadas com cuidado. Depois de isolar o RNA das amostras de soro, continue com a transcrição reversa para obter DNA complementar mais estável para dPCR.Para começar, descongele o kit de transcrição reversa no gelo. Em seguida, gire as enzimas e os primers para baixo. Em seguida, prepare a mistura master conforme

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Aqui nós descrevemos um otimizado multiplex da transcriptase reversa PCR quantitativo protocolo (qRT-PCR) em combinação com uma plataforma microfluídica como ferramenta de triagem de custo e tempo efetivo de alto rendimento para microRNA (miRNA) níveis de expressão, especialmente quando se trabalha com quantidades limitadas de amostra.

Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

Biomarcadores de medição em amostras biológicas complexas é cada vez mais guiando tomada de decisão clínica. Nós descrevemos um método altamente sensível para medir simultaneamente miosina cardíaca binding protein-C, MB da creatina quinase e troponina I em amostras de soro de pacientes com infarto do miocárdio e controle de indivíduos saudáveis.

Um método de quantificação sensível e específico para Determinação do Serum miosina cardíaca Binding Protein-C por Imunoensaio electroquimioluminescência

MicroRNAs circulam surgiram recentemente como biomarcadores promissoras e inovadoras para vários tipos de câncer e outras doenças. O objetivo deste artigo é discutir três diferentes plataformas baseadas em sonda de PCR em tempo real e métodos que estão disponíveis para quantificar e determinar a abundância de microRNAs em circulação.

Baseado-Probe-PCR em tempo real Abordagens para a medição quantitativa de microRNAs

Um método sensível e preciso para quantificação de microRNAs livres de células usando uma química baseada em corante e tecnologia de PCR digital de gotículas é descrito.

Circulando MicroRNA Quantificação Usando DNA de ligação Dye Química e Gota Digital PCR

MicroRNAs desempenhar um papel regulador importante e estão a emergir como novos alvos terapêuticos para várias doenças humanas. Tem sido demonstrado que miARNs são realizadas em lipoproteínas de alta densidade. Nós desenvolvemos um método simplificado para isolar rapidamente HDL purificada adequada para análise de miARN a partir de plasma humano.

Rápido e simplificado método para isolamento alto Através-put de miRNA de altamente purificada lipoproteína de alta densidade

Este relatório descreve um protocolo para medir os níveis absolutos de plasma miRNA, usando quantitativo em tempo real a transcrição reversa PCR com ou sem pré-amplificação. Este protocolo permite melhor entendimento da quantidade de plasma miRNAs e permite a avaliação qualitativa da correspondentes dados de diferentes estudos ou laboratórios.

Quantificação absoluta dos níveis plasmáticos de MicroRNA em macacos Cynomolgus, usando o quantitativo em tempo real a transcrição reversa PCR

micro-RNAs (miRNAs) são sequências de RNA curtas e altamente homólogas, servindo como reguladores pós-transcricional de RNAs mensageiro (mRNAs). Métodos de deteção de miRNA atuais variam em sensibilidade e especificidade. Descreveremos um protocolo que combina a hibridação in situ e imunocoloração para a deteção simultânea de moléculas miRNA e proteína em cortes de tecido de coração de rato.

Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in Situ

Este artigo apresenta um protocolo para detectar a expressão de microRNAs nos rins de um modelo de camundongo com lesão renal aguda usando reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa em tempo real. Este protocolo enfatiza um modelo de camundongo com lesão renal isquêmica e a extração cuidadosa de amostras de microRNA.

Um método de detecção quantitativa para microRNAs no rim de um modelo de camundongo com lesão renal isquêmica

Este protocolo descreve o método detalhado de PCR de gotículas digitais (dd-PCR) para quantificação precisa dos níveis de RNA circular (circRNA) em células usando primers divergentes.

Quantificação de RNAs circulares usando PCR de gotículas digitais

O modelo do rato de infarto agudo do miocárdio (IAM) é útil para estudar as consequências do enfarte do miocárdio sobre a função fisiológica e fisiopatológica cardíaca.

Infarto Agudo do Miocárdio em Ratos

Aprenda a usar PCR digital para quantificar microRNAs circulantes em amostras de soro de pacientes com doenças cardiovasculares. Este método oferece maior precisão sem necessidade de curvas padrão.

PCR digital para quantificar circulando MicroRNAs no infarto agudo do miocárdio e doença Cardiovascular

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