PCR digital para quantificar circulando MicroRNAs no infarto agudo do miocárdio e doença Cardiovascular

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do diagnóstico, como se os micro RNAs são biomarcadores válidos em doenças cardiovasculares. Em comparação com a PCR quantitativa em tempo real, a PCR digital exibe qualidades técnicas superiores para quantificar microRNAs na circulação. Como a amostra é dividida em cerca de 20.000 gotículas, nenhuma medição duplicada é necessária e nenhuma curva padrão é necessária para quantificação.

Embora este método possa fornecer informações sobre a quantificação de microRNAs em pacientes cardiovasculares, ele também pode ser aplicado a outros pacientes e doenças, pois outros microRNAs têm se mostrado promissores como biomarcadores na progressão do câncer, também pode ser aplicado a pacientes oncológicos. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades porque as gotículas geradas são frágeis e precisam ser manuseadas com cuidado. Depois de isolar o RNA das amostras de soro, continue com a transcrição reversa para obter DNA complementar mais estável para dPCR.

Para começar, descongele o kit de transcrição reversa no gelo. Em seguida, gire as enzimas e os primers para baixo. Em seguida, prepare a mistura master conforme descrito no protocolo de texto.

Combine 10 microlitros da mistura principal com cinco microlitros de RNA extraído em cada poço de uma placa de 96 poços. Em seguida, centrifugue a placa a 2.000xg a quatro graus Celsius por dois minutos. Prossiga com a transcrição reversa conforme detalhado no protocolo de texto.

Primeiro, descongele a mistura comercial de dPCR, cDNA e primers de PCR em gelo e centrifugue imediatamente antes do uso. Em seguida, prepare a mistura principal conforme descrito no protocolo de texto. Adicione volumes de 1,33 microlitros de produto de transcrição reversa a volumes de 18,67 microlitros da mistura master e centrifugue brevemente.

Usando uma pipeta, transfira 20 microlitros da amostra para cada poço da fileira média de um de oito poços. Em seguida, pipete 70 microlitros de óleo de geração de gotículas nos poços de óleo do. Em seguida, coloque uma junta em cima do e coloque-a no gerador de gotículas.

Feche o gerador de gotículas e espere até que as três luzes indicadoras fiquem verdes sólidas. Usando uma pipeta, transfira cuidadosamente 40 microlitros da amostra formada por gotículas para poços separados de uma placa de 96 poços. Em seguida, sele a placa com papel alumínio dPCR a 180 graus Celsius por quatro segundos.

Coloque a placa PCR selada no ciclador e siga as instruções de ciclagem descritas no protocolo de texto. Remova a placa do termociclador e transfira-a para a base de um suporte de placa. Em seguida, coloque a parte superior do suporte da placa na placa PCR.

Por fim, inicie o software dPCR comercial. Nesse protocolo, a PCR digital foi utilizada para quantificar microRNAs no soro de pacientes com doença cardiovascular. As amostras foram coletadas de 16 pacientes antes, oito horas após e 16 horas após a intervenção percutânea.

Pacientes com infarto do miocárdio com supradesnivelamento do segmento ST apresentaram um aumento significativo nos níveis de miR-499 em comparação com pacientes com doença arterial coronariana estável. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de uma hora para a formação de gotículas de 96 amostras, se for feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante ter em mente manusear as gotículas com cuidado.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como realizar a PCR digital corretamente, corrigindo a formação, ciclagem, leitura e análise de gotículas.