Geração de reconstruções organotípicas de pele completa: um procedimento para estabelecer um modelo de pele 3D usando amostras de pele humana

A pele consiste principalmente em uma camada epidérmica superior e uma camada dérmica inferior. As células epidérmicas são estratificadas em múltiplas camadas, desde as células menos diferenciadas presentes na base até as células altamente diferenciadas na periferia. Para cultivar um tecido cutâneo que imite os aspectos morfológicos e bioquímicos da pele normal, podemos estabelecer um modelo de pele organotípica.

Para começar, pegue uma placa de vários poços com uma inserção membranosa. Adicione fibroblastos dérmicos misturados com colágeno à inserção. Incube para facilitar a solidificação da matriz de colágeno para incorporar os fibroblastos e imitar o compartimento dérmico da pele.

Em seguida, adicione uma suspensão de células de queratinócitos sobre a camada dérmica. Incube a placa para permitir que os queratinócitos adiram ao compartimento dérmico. Suplementar a cultura com um meio de epidermalização para iniciar a proliferação de queratinócitos e a formação de uma camada epidérmica.

Por fim, transfira as pastilhas para uma nova placa de vários poços. Adicione um meio de estratificação de modo que cubra apenas a base da construção, criando assim uma interface ar-líquido. Após a incubação, a interface ar-líquido facilita a diferenciação dos queratinócitos em uma epiderme estratificada de várias camadas.

No protocolo a seguir, geraremos reconstruções organotípicas da pele 3D com contrapartes dérmicas e epidérmicas a partir de células isoladas da pele humana.

Para gerar a contraparte dérmica das reconstruções da pele, coloque inserções de membrana de tamanho de poro de 8 micrômetros em uma placa de cultura de células de 24 poços. Para cada inserção, ressuspenda 100.000 fibroblastos em solução de neutralização em gel. Em seguida, misture rapidamente a suspensão de fibroblastos com colágeno tipo 1 na proporção de 1:3 em um volume final de 500 microlitros sem formar bolhas.

Em seguida, use uma pipeta para adicionar a suspensão a cada inserção. Dentro de um capuz estéril, coloque as inserções em temperatura ambiente sem meio por 30 minutos para permitir que os géis dérmicos assentem. Em seguida, cubra os géis com DMEM e incube durante a noite a 37 graus Celsius.

Após a incubação noturna, remova o DMEM dos géis dérmicos e equilibre-os com EGM por 2 horas a 37 graus Celsius para gerar a contraparte epidérmica das reconstruções da pele. Em seguida, use uma pipeta para remover o EGM dos géis.

Em seguida, sele cuidadosamente 100.000 queratinócitos ressuspensos em 100 microlitros de EGM em cima de cada gel. Incube as reconstruções por 1,5 horas a 37 graus Celsius para permitir que os queratinócitos adiram ao gel dérmico. Usando uma ponta de pipeta, remova cuidadosamente o gel residual da parede de inserção.

Em seguida, cubra cada reconstrução com 800 microlitros de EGM e cultive por 7 dias a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.

Remova cuidadosamente o gel residual da parede de inserção com uma pequena ponta de pipeta branca.

No dia 8, coloque as inserções em poços separados de uma placa de 6 poços. Em seguida, adicione 1,2 a 1,4 mililitros de meio de melanoma metastático a cada poço para cobrir apenas a base da reconstrução da pele. Em seguida, incube por 10 a 17 dias a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.

• 3D Skin Models - Three-dimensional constructs mimicking natural skin structures
• Human Skin Samples - Biopsy samples of human skin used for scientific study.
• Epidermalization - The process of keratinocyte proliferation and formation of an epidermal layer.
• Organotypic Skin Culture - A method to grow skin tissues that mimic normal skin.
• Reconstructs - 3D skin models created from isolated human skin cells.

• Introduce 3D Skin Models: These are laboratory-grown structures that mimic the natural layers of skin (e.g., human skin samples).
• Key Concepts: They involve processes like epidermalization, that replicate skin cell behaviour (e.g., epidermalization).
• Underlying Mechanisms: The constructs are created by embedding cells in collagen and refining them in different stages.
• Connect to Experiment: The experiment involves creating an organotypic skin culture using a multi-well plate and cell substances.

• What are 3D Skin Models and how are they established (including organotypic skin culture)?
• What does the process of epidermalization entail?
• What are the mechanisms used in creating skin reconstructs?

• Describe Practical Applications: 3D skin models are vital in dermatological research and skincare product testing (e.g., 3D skin models).
• Industry Impact: They greatly influence sectors like healthcare and cosmetology (e.g., human skin samples).
• Societal Importance: Advancements in skin models can benefit personalized medicine and reduce animal testing (e.g., reconstructs).
• Link to Scientific Advancements: They enable understanding of skin diseases and testing of potential treatments.