Name: 3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Aprenda a cultivar células epiteliais tímicas medulares em sistema organotípico 3D com fibroblastos humanos. Este método melhora proliferação, diferenciação e manutenção da expressão gênica promíscua em mTECs.

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Este trabalho foi apoiado pelo Centro Alemão de Pesquisa do Câncer (DKFZ), o consórcio da UE "Tolerage", o Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) e o Landesstiftung Baden-Württemberg.

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Regierungspräsidium Karlsruhe. Todos os animais foram alojados em condições específicas isentos de agentes patogénicos no centro de pesquisa alemão do cancro (DKFZ). Para todas as experiências de cultura de filhotes de rato que variam de 1 a 7 dias de idade foram usados. 1. Isolamento de células mTEC de Thymus NOTA: As etapas seguintes de digestão foram realizadas conforme descrito anteriormente 1 sob condições estéreis, com algumas modificações como se segue. <ol><li> Decapitar os filhotes de rato e remover o timo. Coloque a timos em gelo em uma placa de Petri contendo meio RPMI 1640 (contendo FCS a 5%). </li><li> Corte o thymi em finos, pequenos pedaços e coloque em um tubo de fundo redondo com ~ 5-30 ml de meio RPMI e misture delicadamente usando um ímã para 10 min a RT. </li><li> Depois disso, decantar o sobrenadante contendo principalmente timócitos e digerir o tecido restante sequencialmente com uma rodada de collagenaSE tipo IV (0,2 mg / ml e 57 U / ml de concentartion final) durante 15 minutos cada, a 37 ° C, seguido de colagenase / dispase (0,2 mg / ml e a concentração final de 1,2 U / ml) durante 25 min cada a 37 ° C em um banho de água com agitação magnética até a timos são completamente digerido. Use 1 ml de enzima por 2-3 thymi. </li><li> Agita-se o tecido uma vez a cada 7-10 min com uma pipeta de Pasteur. Reunir as fracções de colagenase / dispase e filtrar através de uma gaze 70 mm. </li><li> Enriqueça as células mTEC por célula magnética triagem (MACS). Realizar a purificação de células mTEC por célula magnética triagem como descrito anteriormente 11, e mostrado na Figura 1. NOTA: Para triagem magnética de células mTEC foram utilizados os seguintes anticorpos: anti-CD80-PE (16-10A1, use a diluição 1: 100) e anti-EpCAM-bio (G8.8, uso a diluição 1: 100) 12. Células mTEC imaturos e maduros usando MACS foram definidos como: CD45 - EpCAM + CD80 - e CD45 - CD80 + respectivEly. </li><li> Após purificação MACS (pureza de células mTEC imaturos = 83,1 ± 6,3% e células mTEC maduros = 79,23 ± 3,42%), semear as células mTEC para as culturas organotípicas conforme descrito abaixo (Seção 2.3). </li><li> Alternativamente, células mTEC ordenar por FACS (utilizando 100 bocal mm) após a depleção de CD45 MACS utilizando os seguintes anticorpos: anti-CD45-PerCP (30-F11, em utilização diluição 1: 100), anti-FITC-Ly51 (6C3, usar a 1 : 100 de diluição), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, a utilização de 1: 500 de diluição) e utilização de anti-CD80-PE (16-10A1, a diluição 1: 100). Excluir células mortas, utilizando iodeto de propídio (1: 5000) (Dia 4). Células mTEC imaturos e maduros usando FACS foram definidos como: PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 - e PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 +, respectivamente. </li></ol> 2. organotï¿½icas 3D Co-culturas (OTCs) NOTA: As construções em 3D-dérmica para o cultivo de organotípico keratinocytes foram preparados como descrito anteriormente 9,13. Em todos os passos células foram incubadas a 37 ° C e 5% de CO 2. Os OTC utilizando células mTEC foram preparadas com pequenas modificações como se segue. <ol><li> Preparação de fibroblastos humanos NOTA: Os fibroblastos dérmicos humanos foram obtidos a partir de culturas de explantes de derme epidermised-de 9, como descrito anteriormente. <ol><li> Em breve, cortar tiras de pele humana (aproximadamente 5 cm de comprimento) e trata-se com termolisina (0,5 mg / ml em solução salina com 10 mM de Hepes pH 7,4) O / N a 4 ° C. </li><li> Em seguida, separar a epiderme da derme utilizando pinças. </li><li> Finamente cortada a derme em pedaços pequenos, coloque em uma placa de 10 centímetros de Petri e deixar secar durante 1-2 horas sob um fluxo de ar estéril. Suplemento os explantes regularmente com DMEM contendo 20% de FBS. </li><li> Divida os fibroblastos em crescimento fora quando confluentes (geralmente em torno de 3 semanas), utilizando 0,1% de tripsina certificando-se que os explantes continuar a aderir à placa para obter mais conrounds consecutivos de crescimento. </li><li> Expandir os fibroblastos a partir de explantes para os mesmos até 3 vezes em DMEM com FBS a 10% e crio-conservação 14. Utilizar o mesmo lote de fibroblastos para cada série experimental. NOTA: Os fibroblastos não foram irradiadas para o set-up dos equivalentes dérmicos. </li></ol></li><li> Preparação do andaime <ol><li> Corte as 0,4-0,6 mm de espessura de viscose, material fibroso não tecido (detalhes do produto no apoio folha de excel) em círculos bem demarcadas usando uma afiada 11 mm de diâmetro de metal perfurador para caber exatamente em 12 inserções bem-filtro. Em seguida, coloque-o na 12- elemento filtrante bem (poliéster poros da membrana capilar, 3 mm de tamanho de poro) como um andaime. Coloque a configuração completa em um filtro estéril de 12 poços. </li><li> Prepara-se o gel de fibrina utilizando uma cola de fibrina kit para a cirurgia que consiste de uma combinação de f ibrinogénio e trombina. Pré-diluir a fibrinogen-, bem como o componente de trombina do kit para 8 mg / ml e 10unidades / ml, respectivamente. Para um único poço de uma placa de 12 poços proceder da seguinte forma. <ol><li> Dilui-se 100 ul de fibrinogénio (8 mg / ml) com 100 ul de solução salina tamponada de fosfato (PBS) sem Ca 2+ e Mg 2+, pH 7,0. Dilui-se 100 ul de trombina (10 unidades / ml) com 100 ul de FCS contendo 270.000 fibroblastos. </li><li> Dispensar 200 ul de trombina a fibroblastos de células contendo-o para misturar andaime, a qual Adicionar 200 ul de fibrinogénio (mistura 1: 1), resultando numa concentração final de fibrinogénio de 2 mg / ml de trombina e de 2,5 unidades / ml. Misturar bem e distribua uniformemente sobre toda a área do andaime por pipetagem suave (Dia 1). NOTA: Depois de 30 min a 37 ° C de um coágulo que encerra os fibroblastos se ter formado, enchendo completamente os espaços internos do andaime e formar uma superfície superior lisa. </li></ol></li></ol></li><li> Co-cultura com células mTEC <ol><li> Para pré-cultura, mergulhe as culturas de órgãos emDMEM com FBS a 10%, 50 ug / ml de ácido L-ascórbico e de 1 ng / ml de TGF-β1 com uma mudança de meio todos os outros dias durante 4-5 dias. </li><li> No dia da sementeira MTEC, substituir o meio por meio RFAD (1: 1 DMEM + DMEM / F12) com 10% de FBS, 10 -10 M a toxina da cólera, 0,4 mg / ml de hidrocortisona, 50 ng / ml de ácido L-ascórbico, ligando RANK (0,1 ug / ml) e 500 unidades / ml de aprotinina, evitando assim a fibrinólise precoce por serina-proteases secretadas pelos fibroblastos. </li><li> 7-8 horas mais tarde, as set-up co-culturas, semeando 250.000 células mTEC (quer células mTEC completos, ou CD80 lo e subconjuntos CD80 hi), num volume de 100 ul por poço em cima do andaime de fibroblastos. Contar as células usando uma câmara de Neubauer (dia 4). NOTA: Em todas as vezes as culturas organotípicas 3D timo estão submersos em meio ao contrário OTCs pele que são levantadas ao ar. </li><li> Após 24 horas de incubação, fornecer as culturas com meio (câmbio médio total) como mencionado acima (passo 2.3.2) agora containing reduziram quantidades de aprotinina, 250 unidades / ml (dia 5). </li><li> A fim de avaliar a actividade proliferativa de células mTEC, adicionar EdU (6,7 uM / ml, ou seja, 10 pM / poço) para OTC durante 4 horas antes da terminação das culturas. Realizar a coloração de OTC crio-secções, como descrito no kit de EdU de imagem conjugados com co-coloração de queratina 14. Determinar os índices proliferativas de células mTEC, tanto por contagem de células K14 + edu + de duas secções de cada espécime de cultura ou por fluxo citometria (EdU citometria de fluxo, Secção 1.7, mas em vez de utilizar Ly51-FITC CDR1 PB-15 a uma diluição de 1: 100 e 2.3.6.4). </li><li> Na sequência de 4-7 dias de co-cultura, encerrar os OTCs e processo para isolamento do RNA, crio-seccionamento ou análise FACS (dia 11/08). <ol><li> Terminar as culturas usando uma pinça, que separa o andaime / equivalente dérmico do filtro do poço de inserção. </li><li> Para crio-seccionamento, incorporar toda a OTC em composto outubro e congelar na livapor de nitrogênio quid antes de crio-seccionamento. Prepare 5-7 uM secções espessas OTC utilizando um criostato e armazenar a -20 ° C até à sua utilização. Para imuno-histoquímica de OTC crio-seccionado usar anti-queratina 14 (AF64, a utilização de 1: 1000 de diluição), e anti-vimentina (gp53, utilização em diluição 1: 100) de anticorpos. Realizar a coloração imuno-histoquímica indireta usando anticorpos secundários respectivos. </li><li> Para o isolamento do RNA, adicionar 1 ml de solução (contendo fenol e tiocianato de guanidina) em uma tampa de rosca de um 2 ml RNase livre tubo de desnaturação. Cortar toda a OTC em pedaços com um bisturi e adicionar para dentro do tubo contendo solução de desnaturação. Mecanicamente triturar os OTC com instrumento FastPrep duas vezes durante 30 segundos a uma velocidade de 6,0, em colocar entre em gelo durante 2 minutos (a amostra pode ser armazenada a -80 ° C após este ponto). Se congeladas a -80 ° C, descongelar em gelo. Centrifugar os tubos a 11,500-13,000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco, incubar durante 5 min à temperatura ambiente e fprotocolos de isolamento de ARN Realize as utilizando ácido extracção tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio, tal como descrito pelo fabricante. </li><li> Para a análise FACS, remover o andaime e separar a membrana da fibrina / fibroblastos / gel MTEC. Finamente cortada do gel com um bisturi e digeri-la num tubo de FACS durante ~ 20 min, ou até estarem completamente digeridas com 2 ml de colagenase / dispase a 37 ° C num banho de água com agitação magnética. Agita-se a solução de enzima com uma pipeta de Pasteur, uma vez a cada 5 minutos. Após a digestão completa, filtra-se a suspensão de células através de um filtro de 70 um; manchar a suspensão de célula única usando os anticorpos, tal como descrito em 1.7 e análise por citometria de fluxo. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+gene+expression+in+medullary+thymic+epithelial+cells+mirrors+the+peripheral+self%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self.</a> Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).</li>
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<li>Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+organization+and+differentiation+of+HaCaT+keratinocytes+in+organotypic+coculture+with+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts.</a> J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não há conflito financeiro ou comercial de interesse.

Ao lado RTOCs, o OTCs 3D têm sido, de longe, superior em termos de diferenciação do TCE e PGE manutenção / indução (Tabela 1) em comparação com outros (i) &#39;culturas 3D simplificadas&#39; usando - fibroblastos sozinho, sem o cadafalso; (Ii) sistemas 2D utilizando - células fibroblastos / alimentador de co-cultivadas com TEC 10, (iii) células 3T3-J2 em que os clones TEC desenvolver, mas é perdida PGE, (iv) Matrigel ou (v) de componentes da matriz extracelular (dados não publicados). PGE foi...

Timócitos desenvolvimento perfazem cerca de 98% do timo, enquanto que os restantes 2% é composto por uma variedade de células que compõem colectivamente o estroma tímico (isto é, células epiteliais, células dendríticas, macrófagos, células B, f ibroblastos, células endoteliais). As células epiteliais cortical exterior (CTECs) adquirir imigração de células pro-T a partir de medula óssea, t indução linhagem celular em células pré-T multipotentes e selecção positivo de auto-MHC restrita timócitos imaturos. As células interiores medulares do timo epiteliais (células mTEC) estão envolvidas na indução de tolerância desses timócitos com um TCR de elevada afinidade para complexos de auto-péptido / CPH por indução ou selecção negativa ou seu desvio para a linhagem de células T reguladora. No contexto da indução de tolerância central, células mTEC são únicos na medida em que expressam uma ampla gama de auto-antigénios restrita a um tecido (TRAs) espelhamento assim a auto periférica. Este fenômeno é chamado de expressão gênica promíscua (PGE)1,2. A maioria dos estudos actuais sobre este tipo de célula fascinante dependem ex vivo células isoladas, como vários sistemas de cultura de curto prazo 2D invariavelmente resultou na perda de moléculas de PGE e como regulador chave do MHC de classe II, e Foxn1 Aire dentro dos primeiros 2 dias 06/03 . Ele permaneceu no entanto claro, que determinados componentes e características da malha 3D intacta do timo estavam faltando em modelos 2D. A cultura de órgão tímico re-agregação (RTOC) tem sido até agora o único sistema 3D, que permite o estudo do desenvolvimento de células T, por um lado, e da biologia celular de estroma, por outro lado, em um micro-ambiente do timo 7 intacto. No entanto, RTOCs tem certas limitações, isto é, que já contêm uma mistura complexa de células, requerem a utilização de células estromais fetais e suportar um período de cultura máxima de 5 a 10 dias. A falta de redutora em sistemas de cultura in vitro tem dificultado o estudo dovários aspectos do desenvolvimento de células T do timo e organogênese não menos importante a regulação molecular da PGE e sua relação com a biologia do desenvolvimento de células mTEC. Devido à estreita-relação da organização estruturada das células epiteliais da pele e do timo, optamos por um sistema 3D cultura organotípicas (OTC), que tinha sido desenvolvido originalmente para emular a diferenciação de queratinócitos in vitro e, assim, criar um equivalente dérmico. O sistema OTC consiste em uma matriz de andaime inerte coberto com fibroblastos dérmicos que estão presos em um gel de fibrina, na qual os queratinócitos são semeados 8,9. Aqui, nós substituímos queratinócitos com células mTEC purificados. Mantendo as características básicas deste modelo, nós otimizamos determinados parâmetros. No modelo adotado OTC células mTEC proliferaram, foram submetidos a diferenciação terminal e mantido identidade MTEC e PGE, assim estreitamente imitando in vivo células mTEC desenvolvimento <sup&gt; 10. Esta nota técnica proporciona um protocolo detalhado permitindo que o passo a passo set-up de OTCs timo.

<table><tbody><tr><td>Camundongos C57BL/6 prenhes&nbsp;</td><td>Charles River WIGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS colunas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MS colunas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Microesferas, rato</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas Anti-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas de estreptavidina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (G8.8 -Alexa 647 e -biotina)</td><td>Ref. 12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD80-PE anticorpo</td><td>BD Pharmingen</td><td>553769</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PerCP</td><td>BD Pharmingen</td><td>557235</td><td></td></tr><tr><td>Ly51-FITC anticorpo</td><td>BD Pharmingen</td><td>553160</td><td></td></tr><tr><td>CDR1-Pacific</td><td>Blue Ref. 15</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Queratina 14 anticorpo</td><td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin anticorpo</td><td>Progen</td><td>GP58</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-conjugado AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-conjugado AffiniPure F(ab')2 Fragmento de cabra anti-cobaia IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>106-546-003</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) de cabra, Sondas moleculares conjugadas Alexa Fluor 488</td><td>(Invitrogen GmbH)</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Kit de imagem</td><td>Invitrogen</td><td>C10339</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de ensaio de citometria de fluxo</td><td>Invitrogen</td><td>C10425</td><td></td></tr><tr><td>Inserções de filtro de 12 poços (thincerts)</td><td>Greiner bio-one</td><td></td><td></td>657631</tr><tr><td>Placa de 12 poços</td><td>Greiner</td><td>665180-01</td><td></td></tr><tr><td>Jettex 2005/45</td><td>ORSA, Giorla Minore, Itália</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogênio TISSUECOL-Kit Immuno</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trombina TISSUECOL-Kit Immuno</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Serva</td><td>47302.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-049&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina (Trasylol)</td><td>Bayer</td><td>4032037</td><td></td></tr><tr><td>Toxina da cólera</td><td>Biomol</td><td>G117</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Seromed (Biochrom)</td><td>K3520</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&szlig; 1</td><td>Invitrogen</td><td>PHG9214</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>R& D systems</td><td>462-TR-010</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; T-7902</td><td></td></tr><tr><td>OCT Composto</td><td>TissueTek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (aka. Solução desnaturante - Extração ácida de tiocianato-fenol-clorofórmio de guanidínio)</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep FP120</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Tipo IV&nbsp;</td><td>CellSystems</td><td>LS004189</td><td>0,2 mg / ml e 57U / ml conc final.</td></tr><tr><td>Neutrale Protease (Dispase)</td> <td>CellSystems</td><td>LS002104</td><td>0,2 mg / ml e 1,2U / ml conc final.</td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11 284 932 001</td><td>25 &micro; g/ml de concentração final.</td></tr></tbody></table>

3d organotípicas co-cultura modelo de apoio medular thymic epithelial proliferação, diferenciação e expression promiscuous gene

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Desenvolvimento de células T intra-timo requer uma malha tridimensional complexa composta por várias células do estroma, ou seja, células não-T. Timócitos atravessar este andaime em uma ordem temporal e espacial altamente coordenada enquanto sequencialmente passar pontos de verificação obrigatórios, ou seja, T compromisso linhagem de células, seguido de geração repertório receptor de células T e seleção antes da sua exportação para a periferia. Os dois tipos de células residentes principais que formam este andaime são células epiteliais do timo corticais (CTECs) e medular (células mTEC). Uma característica chave de células mTEC é o chamado promíscuo expressão de numerosos antigénios restrita a um tecido. Estes antigénios restrita a um tecido são apresentados para os timócitos imaturos, directa ou indirectamente por células mTEC ou células dendríticas do timo, respectivamente, resultando em auto-tolerância. Adequados in vitro modelos emulando as vias de desenvolvimento e as funções de CTECs e células mTEC Atualmente lacrei. Esta falta de modelos experimentais adequados, por exemplo, tem dificultado a análise da expressão do gene promíscuo, que ainda está mal compreendida no nível celular e molecular. Nós adaptamos um modelo de co-cultura 3D organotípico à cultura ex vivo células mTEC isoladas. Este modelo foi inicialmente criado para cultivar queratinócitos, de modo a gerar um equivalente de pele in vitro. O modelo 3D preservou as características funcionais do MTEC biologia: (i) a proliferação e diferenciação terminal de CD80 lo, Aire-negativo em CD80 oi, Aire-positivo células mTEC, (ii) capacidade de resposta a RANKL, e (iii) a expressão sustentada de Foxn1, Aire e genes restrita de tecidos em células mTEC CD80 hi.

Adotamos um modelo 3D organotípico co-cultura (3D OTC) que tinha sido originalmente desenvolvido para o cultivo in vitro de longa duração dos queratinócitos 9. Células mTEC MACS enriquecidos (ver esquema de enriquecimento MACS Figura 1) foram semeadas em um andaime que compreende de um gel de fibrina e fibroblastos aprisionadas. Os fibroblastos proporcionar a matriz extracelular essencial (ECM) que suporta células mTEC in vitro. Células mTEC foram cultivadas em OTCs...

O estudo de células epiteliais tímicas medulares in vitro não teve sucesso, pois os sistemas de cultura 2D atuais não imitam o cenário in vivo. O sistema de cultura 3D aqui descrito - um modelo de cultura organotípica de pele modificada - provou ser superior na recapitulação da proliferação, diferenciação e manutenção da expressão gênica promíscua.

3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

O objetivo geral deste procedimento é cultivar células epiteliais medulares timicas, ou mtech, em um sistema de cultura organotípica tridimensional, ou OTC. Isso é realizado primeiramente colocando o material de suporte fibroso em um inserto de filtro de 12 poços, seguido pela sobreposição de um gel de fibrina recém-preparado contendo fibroblastos dérmicos humanos. Após quatro a cinco dias de pré-cultivo, os MTS são posicionados sobre o suporte e cultivados em condições de cultura submersa.Por fim, pode-se realizar imunohistoquímica, isolamento de RNA e análises nos cultivos mistos para avaliar o desenvolvimento do CED Mtech. A principal vantagem dos sistemas de cultivo misto tridimensionais em relação aos sistemas de cultura bidimensionais existentes é que eles são muito superiores na recapitulação da diferenciação e proliferação do Mtech, bem como na manutenção da expressão gênica promíscua. Hoje, quem demonstrará esta técnica será Iris Martin, uma técnica do nosso laboratório colaborador.Quando os fibroblastos dérmicos humanos atingirem confluência, prepare as fibras do suporte fervendo, secando e passando a ferro os pedaços de material fibroso não tecido viscoelástico com espessura de 0,4 a 0,6 milímetros. Utilize um furador metálico para cortá-los em círculos de 11 milímetros. Coloque o material fibroso cortado entre duas lâminas, envolva as lâminas em papel alumínio e autocalefe-as.Uma vez esterilizados, coloque os inserts nas cavidades de uma placa estéril de 12 poços e, em seguida, cada andamio em um insert correspondente. Em seguida, misture 2,7 vezes 10 à quinta fibroblastos em 100 microlitros de soro fetal bovino com 100 microlitros de trombina recém-diluída por andamio. Dispense a mistura de trombina e fibroblastos sobre cada andamio, seguida de 200 microlitros de fibrinogênio recém-diluído.Em seguida, misture a suspensão celular em cada poço, distribuindo uniformemente a solução por toda a extensão do suporte com pipetagem suave. A imagem mostra o crescimento dos fibroblastos dérmicos humanos com o gel de fibrina no primeiro e no quarto dia de cultivo. Prepare um gel de teste em um poço controle sem suporte para acompanhar o tempo e a formação dos coágulos nesse período também.Avalie a formação do coágulo utilizando uma ponta de pipeta ou invertendo a placa após os fibroblastos terem coagulado; submerja as culturas de órgãos em meio suplementado com ácido L-sorbílico e TGF-beta 1 por quatro a cinco dias. No dia da semeadura de mTEC, substitua este meio por meio RFAD contendo 500 unidades por mililitro de aprotinina para prevenir fibrinólise precoce. Sete a oito horas depois, semeie 2,5 vezes 10 à quinta potência de mTEC suspensas em 100 microlitros de RFAD sobre a superfície de cada suporte e incube as culturas em co-cultivo por 24 horas. No dia seguinte, substitua o meio por meio fresco contendo 250 unidades por mililitro de aprotinina por mais quatro a sete dias de cultivo.Para avaliar o desenvolvimento dos m Texs por imunohistoquímica ao final do cultivo, utilize um par de pinças para separar o equivalente dérmico do suporte do filtro de cada poço e inclua os OTCs em composto OCT. Congele os OTCs na fase gasosa sobre nitrogênio líquido para isolar o O-T-C-R-N-A.Após separar o tecido suporte dos filtros, use um bisturi para cortar os OTCs em pedaços e transfira os fragmentos para um tubo livre de RNA de dois mililitros contendo um mililitro de solução desnaturante. Usando um instrumento de preparo rápido, homogenize mecanicamente os OTCs duas vezes, a uma velocidade de 6,0 durante 30 segundos cada vez, com um período de repouso de dois minutos no gelo entre cada homogenização. Em seguida, isolue o RNA utilizando extração com tiocianato de guanidina ácida, fenol e clorofórmio, conforme descrito pelo fabricante.Para analisar as OTCs por citometria de fluxo, remova a membrana e separe a estrutura do gel de fibrina com fibroblastos mtech. Em seguida, corte o gel com um bisturi conforme acabou de ser demonstrado. Transfira o tecido para um tubo tipo fax.Continue com dois mililitros da pasta de colagenase. Em seguida, coloque o tubo a 37 graus Celsius em banho-maria com agitação magnética por 20 minutos. Agite com sua pipeta uma vez a cada cinco minutos até que o tecido esteja completamente digerido.Filtre a suspensão celular resultante através de uma peneira de 70 micrômetros e marque as células usando os anticorpos apropriados, conforme ilustrado. Os MTS podem ser identificados pela expressão de queratina 14, o que os distingue facilmente dos fibroblastos positivos para menton. Curiosamente, os M Texs imaturos e maduros exibem padrões de crescimento diferentes, mas altamente reprodutíveis, em cultura.Os MTexs imaturos CD80D de baixa expressão, por exemplo, normalmente formam bicamadas em estreito contato com os fibroblastos. Enquanto os MTS CD80D de alta expressão tendem a formar agregados celulares compactos delimitados pelos fibroblastos, os subtipos mtech não apenas sobrevivem, mas proliferam nas condições tridimensionais de OTC demonstradas, conforme evidenciado pela incorporação de EDU. Curiosamente, os MTechs CD80D de baixa expressão proliferam em uma taxa mais elevada na presença de RANKL.Embora o oposto seja verdadeiro para MT.Techs com alta expressão de CD80, após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como cultivar MT.Techs utilizando OTCs tridimensionais. Este é um método muito superior ao uso de sistemas de cultura bidimensionais em termos de diferenciação de tecidos e manutenção e indução de PGE, com o potencial de estudar ou manipular diversos parâmetros teciduais.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Neste vídeo a preparação de 2-dGuo tratados reaggregate culturas timo é demonstrada.

Reaggregate Culturas Thymus

Este vídeo demonstra a dissecção e remoção do timo fetal, bem como o preparo de culturas ex vivo de 2-dGuo tratados com timo.

Preparação de 2-dGuo-Tratada Culturas Organ Thymus

Este vídeo demonstra um protocolo para gerar células T funcionais específicas do antígeno a partir de células T imaturas derivadas de iPSC usando um sistema de cultura tímica tridimensional. A co-cultura de células T imaturas derivadas de iPSC com lobos tímicos fetais de camundongos empobrecidos de linfócitos endógenos resultou em maturação bem-sucedida das células T para formar emigrantes tímicos derivados de iPSC CD8αβ + MHC classe I + iPSC.

Sistema de cultura tímica tridimensional para gerar emigrantes tímicos derivados de iPSC

Este manuscrito descreve uma técnica suave baseado em litografia para engenharia matrizes uniformes de tridimensional (3D) de tecidos epiteliais geometria definida rodeados por matriz extracelular. Este método é favorável a uma ampla variedade de tipos de células e contextos experimentais e permite o rastreio de alto rendimento de réplicas idênticas.

Engenharia tridimensionais tecidos epiteliais incorporado dentro Matriz Extracelular

Descreve-se a preparação de fatias do timo que, em combinação com a citometria de fluxo, podem ser utilizados para modelar selecção positiva e negativa do desenvolvimento de células T. Fatias do timo pode também ser adaptado para a análise in si tu de migração de timócitos, localização e a sinalização através de imunofluorescência e microscopia de dois fotões.

Preparação e Aplicações de culturas organotípicas Tímico Fatia

Este artigo descreve um método novo para gerar emigrantes Thymic de pilha-derivado induzido antígeno-específico do tumor (iTE) por um sistema Thymic tridimensional da cultura (3D). iTE é um subconjunto homogêneo de células T intimamente relacionadas com células T ingênuas com a capacidade de proliferação, formação de memória e supressão tumoral.

Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

Aqui, são descritos quatro métodos para a geração de organoides testiculares testiculares de células testiculares neonatais primárias, ou seja, matriz extracelular (ECM) e ambientes de cultura 2D e 3D livres de ECM. Essas técnicas possuem múltiplas aplicações de pesquisa e são especialmente úteis para estudar desenvolvimento testicular e fisiologia in vitro.

Geração extra-baseada em matriz celular e extra-celular livre de organoides testiculares de murina

Este protocolo oferece instruções detalhadas para estabelecer organoides do intestino delgado murine, isolar células linfoides tipo 1 da lamina propria do intestino delgado murina e estabelecer coculturas tridimensionais (3D) entre ambos os tipos de células para estudar interações bidirecionais entre células epiteliais intestinais e células linfoides inatas tipo 1.

Co-Cultura de Organoides Epiteliais do Intestino Delgado Murine com Células Linfoides Inatas

Este protocolo descreve o isolamento de timócitos duplo-negativos do timo de camundongo seguido de transdução retroviral e co-cultura no sistema de co-cultura de linhagem celular estromal de medula óssea delta-like 4 (OP9-DL4) para análise funcional adicional.

Co-cultura e transdução de timócitos murinos em células estromais delta-like 4 expressando para estudo de oncogenes em leucemia de células T

Aqui, descrevemos um protocolo para a formação de organoides de timo derivados de iPSC humanos cultivados em hidrogéis de fibrina 3D com o objetivo de apoiar a maturação e manutenção prolongada das células epiteliais tímicas (TEC), bem como a timopoiese in vitro.

Formação de organoides do timo humano em hidrogéis de fibrina tridimensionais

Para estudar a diferenciação e a função das células T CD8 in vitro, as células T CD8 podem ser isoladas do camundongo para serem co-cultivadas a longo prazo com organoides epiteliais vaginais murinos infectados pré-formados. Aqui, descrevemos esse processo e avaliamos a aquisição dos marcadores residentes de células T da memória após a co-cultura.

In Vitro Diferenciação de Células T CD8 de Memória Residente usando Sistema de Co-cultura Organoide-Célula T Epitelial

Aprenda a cultivar células epiteliais tímicas medulares em sistema organotípico 3D com fibroblastos humanos. Este método melhora proliferação, diferenciação e manutenção da expressão gênica promíscua em mTECs.

3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene

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