Name: Modelando os passos iniciais do cancro do ovário Divulgação em uma cultura organotípicas do Peritoneal Cavity Humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprenda a construir um modelo organotípico tridimensional da cavidade peritoneal humana usando células mesoteliais primárias e fibroblastos. Este método permite estudar adesão, invasão e proliferação de células de câncer de ovário.

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Agradecemos a todos os residentes e médicos assistentes, notadamente ao Dr. A.F. Haney (Universidade de Chicago, Departamento de Obstetrícia e Ginecologia) pela coleta de biópsias omentais. Além disso, agradecemos a Stacey Tobin e Gail Isenberg por editarem cuidadosamente este manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Bears Care, beneficiária beneficente do Chicago Bears Football Club, do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NINDS) R21 NS075702 e do Instituto Nacional do Câncer conceder R01 CA111882 a E.L.

Todos os protocolos de pesquisa descritas foram revistos pela Universidade de Revisão Institucional Chicago Board (IRB). O consentimento informado foi obtido de cada paciente antes da cirurgia e do estudo foi aprovado pela Universidade de Chicago IRB. Um gabinete de segurança biológica do tipo 2 e as luvas devem ser usados ​​ao manusear tecido humano para proteção e para reduzir o risco de contaminação de células. 1. Isolamento e Cultura de células estromais não transformadas primárias <ol><li> Coleta de tecido humano e preparação. <ol><li> Obter amostras de omento humano, 2 cm 3, removida durante uma cirurgia abdominal, e mergulhar imediatamente no tecido RT solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Figura 2A). Um pedaço de omento 3 cm x 2 cm normalmente produz 1 milhão de células primárias humanas mesoteliais (HPMC) e 200.000 fibroblastos humanos primários ou fibroblastos omentais normais (NOF). </li><li> Girar o PBS o tecido foi mergulhado em a 0,5 g durante 3min o mais rapidamente possível após a colheita (&lt;2 h em PBS) e transferir para o tecido fresco 20 mL de PBS num tubo de 50 ml. Corta-se o tecido em 5mm 3 peças por picagem com bisturis em um 15 cm de diâmetro, estéril prato de cultura (Figura 2B). </li></ol></li><li> Isolamento de células mesoteliais humanas primárias 8 <ol><li> Para isolar HPMC, transferir o tecido moído em 50 ml de tubos cónicos e esperar 1 min para os pedaços sólidos a flutuar para o topo (Figura 2C e D). HPMC e glóbulos vermelhos (RBC) estará presente no líquido na parte inferior. Usar uma pipeta para retirar o líquido a partir do fundo do tubo e para um novo tubo cónico. Girar o líquido para baixo, para 0,5 xg durante 3 min e aspirar o sobrenadante do pellet de HPMC / RBC. <ol><li> Repita o processo três vezes: adicionar 20 ml de PBS ao tecido picada, permitir que o tecido a subir, remover o líquido do fundo com uma pipeta e no tubo de HPMC / RBC, girar para baixo, e retire asobrenadante. Depois de todas as rotações são concluídos e o sobrenadante é aspirado, o sedimento conterá HPMC e RBC. </li></ol></li><li> Placa de todas as células a partir do sedimento num frasco de 75 cm 2 em 15 ml de meio de crescimento completo (DMEM com soro a 10% de bovino fetal [FBS], 1% de vitaminas MEM [93 mg / L], 1% de MEM aminoácidos não essenciais ácidos [81,4 mg / l], 1% de penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina]). </li><li> Realize uma lavagem PBS secundário para isolar HPMCs adicionais. <ol><li> Para lavar o secundário PBS, agitar o tecido sólido restante a 200 rpm, 37 ° C durante 10 min em 20 ml de PBS, em seguida, esperar um minuto para o tecido a flutuar para o topo. Remover o líquido a partir do fundo do tubo para um novo tubo, centrifugar a 0,5 xg durante 3 min, e o sobrenadante aspirado. </li><li> Placa toda a HPMC / RBC do PBS secundário lavar em um frasco separado 75 cm 2 em 15 ml de meio de crescimento completo. </li></ol></li><li> Para isolar qualquer remaining HPMC, agitar o tecido moído a 200 rpm, 37 ° C graus durante 10 min em 20 ml de uma mistura 1: 1 0,25% de tripsina 25 mM de EDTA: solução de PBS em volume. Permitir que o tecido a subir, recolher o líquido na parte inferior do tubo em um novo tubo de 50 ml, e a rotação para baixo de 0,5 gx 3 min. <ol><li> Aspirar o sobrenadante e placa toda a HPMC / RBC em um frasco separado 75 cm 2 em 15 ml de meio de crescimento completo. </li></ol></li><li> Cultura das células plaqueadas a 37 ° C e 5% de CO2 num ambiente humidif içado. Alimentar as células banhado, adicionando 15 ml de meio de crescimento completo nos dias 3 e 5 sem a remoção dos meios gastos. HPMC podem ser cultivadas por 5-7 dias antes de se separarem. <ol><li> Use baixa passagem HPMC (até passagem 2) em todos os experimentos para minimizar desdiferenciação e modificação do fenótipo inicial. Use um microscópio de campo amplo de preferência com uma objetiva de 20x com capacidades de contraste de interferência diferencial plástico ou objetivo 4-20x com contraste de fase capabilities (filtros de fase de contraste no microscópio) para tomar todas as imagens das células, e uma objetiva de 10x () no campo claro para analisar imunohistoquímica 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) coloração. </li></ol></li><li> Confirme que a HPMC são cubóide e expressar citoqueratina 8 e vimentina através da realização de imunohistoquímica 8 (Figura 3A, C, E). </li></ol></li><li> NOF isolamento 8 <ol><li> Preparar 10 ml de uma solução de estoque de colagenase de tipo III (10x) por combinação de uma mistura 1: 1 de Pen-Strep 100x:: 1 1.500 unidades de actividade / ml de colagenase de tipo III: Actividade de 714 unidades / ml de hialuronidase em PBS. </li><li> Agitar o tecido omento picada que permanece após HPMC isolamento a 200 rpm, 37 ° C durante 6 horas em 10 ml da solução 10x colagenase tipo III diluída em meio isento de soro (DMEM com 1% de vitaminas MEM [93 mg / L], MEM a 1% aminoácidos não essenciais [81,4 mg / l], 1% de penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina]). Tecido digerido vai olhar opaco e pode ter alguns detritos fibroso (Figura 2E). </li><li> Centrifugar a solução contendo as células NOF em suspensão em 0,5 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente, aspirar o sobrenadante e o sedimento em placa num frasco de 75 cm 2 em 13 ml de meio de crescimento completo. </li><li> Remover a velha mídia e substituir com 15 ml de meio de crescimento completo fresco depois de 24 horas. NOF podem ser cultivadas durante 1-3 dias antes de se separarem. Proliferação nota da NOF cessará quando as células atingem a confluência. </li><li> Confirmar que os fibroblastos humanos primários, as células são alongadas planas e expressar vimentina mas não citoqueratina 8 8 através da realização de imuno-histoquímica (Figura 3B, D, F). Use NOF de baixa passagem para experiências (idealmente antes da passagem 3) para minimizar desdiferenciação e modificação do fenótipo inicial. Use um microscópio de campo amplo com uma objetiva de 20x com capacidades DIC de plástico para tomar todas as imagens de fase de células,e uma objectiva de 10x em campo brilhante para analisar a coloração imuno-histoquímica DAB. </li></ol></li></ol> 2. chapeamento o Organotípicas Cultura 8 <ol><li> NOF lançamento do balão de cultura de 75 cm por lavagem com 10 ml de PBS, seguido de 3 ml de tripsina a 0,25% / EDTA 25 mM, durante não mais do que 5 minutos. Neutralizar a tripsina com pelo menos 3 vezes o volume de meio de crescimento completo. </li><li> Transferir as células tripsinizadas em um tubo de 50 ml e girar para baixo em 0,5 gx 3 min. Remover o sobrenadante e trazer as células de volta em 5 ml de meio de crescimento completo. Utilizar um contador de células para contagem das células recuperadas a partir do balão de cultura. </li><li> Dilui-se as células no volume apropriado de meio de crescimento completo ao prato 2.000-4.000 NOF por 100 ul numa placa preta, clara de fundo, de 96 cavidades. Adicionar 0,5 ug / 100 ul de colagénio de cauda de rato-I da mistura de células antes do plaqueamento. Let células sentar a 37 ° C em 5% de CO2 num ambiente humidif içado, durante pelo menos 4 horas, ou até que as célulaspara aderir à superfície da chapa. </li><li> HPMC liberar a partir do frasco de cultura utilizando os mesmos métodos descritos nos passos 2.1 e 2.2. Dilui-se as células na quantidade apropriada de meio de crescimento completo ao prato 10.000-20.000 HPMC por 50 ul no topo da NOF já revestida com colagénio I, em placas de 96 poços. Permitir que as células se sentar a 37 ° C em 5% de CO2 num ambiente humidif içado durante pelo menos 18 horas antes de iniciar as experiências. </li><li> Cultura proteína fluorescente verde (GFP) -expressing HeyA8 células cancerígenas de ovário em meio de crescimento completo. HeyA8 células cancerosas do ovário está marcado de forma fluorescente por expressão de um vector lentiviral expressando copépodo cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). HeyA8 células cancerosas do ovário deve ser 80-90% confluentes no dia da utilização (fase de crescimento logarítmica). Libertar as células a partir da placa de cultura e contagem usando os mesmos métodos descritos nos passos 2.1-2.2 para células primárias. </li><li> Permitir que as células de cancro do ovário para recuperar num meio de crescimento completo durante 15-20 min a 37 ° C numatubo cónico com a tampa solta selado. </li></ol> 3. Ensaio de Adesão 8 <ol><li> Após a recuperação, sedimentar as células do cancro do ovário por centrifugação durante 3 minutos a 0,5 xg e, em seguida, remover o sobrenadante e dilui-se as células no volume apropriado de meio isento de soro para alcançar uma concentração de 50.000 células / 100 pi. </li><li> Inverter as placas de 96 poços com as culturas organotípicas / NOF HPMC para remover meios gastos, e adicionar 100 uL da suspensão de células de câncer em meio isento de soro a cada poço. Incubar a placa a 37 ° C em 5% de CO2 num ambiente humidif içado, durante 30 min a 4 h. </li><li> Inverta a placa de 96 poços e meios para remover as células não aderentes. Use uma pipeta multicanal com baixo poder de cuidado e gentilmente pipeta 100 ul de PBS em cada poço e inverter placa novamente. Repita o PBS lavar mais uma vez. </li><li> Inverta a remover PBS e adiciona-se 100 ul de paraformaldeido a 4% a cada poço. Permitir que a placa de sentar-se por 20 min para corrigir as células. Após 20 min, inverter a placa e adiciona-se 100 ul de PBS. </li><li> Note-se que a fluorescência total dos poços pode ser reportada ou o número de células pode ser quantificada. Para a quantificação, a primeira placa de uma curva padrão em duplicado utilizando células HeyA8 a uma concentração de 1 milhão de células / ml. <ol><li> Fazer a curva padrão por fiação para baixo 1 milhão de células, removendo mídia, e permitindo-lhes para se sentar em 1 ml de paraformaldeído a 4% durante 20 minutos. </li><li> Células girar novamente e trazer em 1 ml de PBS (células recontagem para confirmar 1 milhão / ml de concentração). Placa de 50.000, 40.000, 30.000, 20.000, 10.000, 5.000, 1.000 e 0 células em cada cavidade, em duplicado, e adicionar PBS para um volume total final de 50 uL em cada poço. </li></ol></li><li> Inferior ler a placa de cultura em um leitor fluorescente placa (excitação = 488 nm, emissão = 528 nm), dimensionamento altos poços (50.000 na curva padrão). Use a curva padrão para calcular quantas células de cancro do ovário aderiram ao organotypIC cultura em cada poço (Figura 4A-C). </li></ol> 4. Ensaio de Proliferação de 10 <ol><li> Após as células de cancro do ovário recuperar (ver passos 2.5 e 2.6, supra), sedimentar as células por centrifugação durante 3 minutos a 0,5 xg e depois dilui-se as células no volume apropriado de 1% de meio de FBS (DMEM com FBS a 1%, 1% MEM vitaminas [93 mg / L], MEM a 1% de aminoácidos não essenciais [81,4 mg / l], 1% de penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina]) para obter uma concentração de 4000 células / 150 ul. </li><li> Inverta a placa de 96 poços com as culturas organotípicas de HPMC / NOF para remover o meio gasto e adicionar 150 uL da suspensão de células do cancro em 1% de meio FBS a cada poço. Incubar a placa a 37 ° C em 5% de CO2 num ambiente humidif içado, durante 72 h. </li><li> Parte inferior da placa de cultura de ler num leitor de placas fluorescente, uma vez por dia (excitação = 488 nm, emissão = 528 nm) para avaliar a proliferação relativade células. Continue o ensaio durante 96 horas, mudando a mídia em 48 horas (Figura 5A-C). Tenha cuidado para não perturbar a cultura quando se muda de mídia (invertendo a placa é preferível). </li></ol> 5. Invasão Ensaio 8 <ol><li> Antes de chapeamento a cultura 3D, adicionar 7,5 g rato-cauda colágeno I em 200 ï¿½ de PBS a um 24 bem inserção placa de cultura (8 mm de tamanho de poro). Deixe a placa incubado O / N, em seguida, retire cuidadosamente a PBS com uma pipeta imediatamente antes do plaqueamento a cultura organotípico HPMC / NOF para as inserções revestidos com colagénio (etapa 2, acima). </li><li> Preparar as células de cancro do ovário como no passo 3.1. Ao prato as células de cancro do ovário para as culturas organotípicas sobre as inserções, utilize cuidadosamente uma pipeta para remover o excesso de mídia a partir do topo das inserções. Adicionar 100 ul da suspensão de células do cancro do ovário em meio isento de soro a cada poço. </li><li> Adicionar 750 ul de meio de crescimento completo na cavidade abaixo da inserção para induzir células no cancrovasion em culturas organotípicas. Incubar a placa a 37 ° C em 5% de CO2 num ambiente humidif içado, durante 24 horas. Nota: As células do cancro do ovário que invadem a cultura organotípica vai atravessar a inserção e permanecem no lado inferior da peça inserta. </li><li> Após 24 horas, segure a inserção com pinças e brevemente enxágüe-la num copo de PBS, em seguida, passar a inserção em um poço vazio. Esfregar a parte superior de cada inserto com dois lados de uma mecha de algodão para um total de 1 min. Rapidamente colocar o inserto para uma placa contendo 750 ul de paraformaldeido a 4% em cada poço. Permitir que cada inserção para sentar-se em paraformaldeído durante 10 minutos antes de transferir as inserções em poços cheios com 750 ï¿½ de PBS. </li><li> Ver as células invadidas (aderidas e fixas à parte inferior das inserções) com um microscópio com uma ampliação de 2,5 vezes. Quando todo o poço está dentro do campo de visão, para ajustar a ampliação de 10x e levar 5 imagens, um perto do centro e um em cada quadrante do poço, evitandoa tomada de imagens que são demasiado perto das bordas. Siga o mesmo padrão para cada poço. </li><li> Usar o programa do fabricante para contar o número de células em cada imagem para obter um número médio de células invadidas por campo em cada poço (Figura 6A-C) de acordo com o seu protocolo. </li></ol>

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<li>Casey, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+in+vitro+assay+to+measure+the+invasion+of+ovarian+carcinoma+cells+through+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).</li>
<li>Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+human+ovarian+tumor+cells+with+human+mesothelial+cells+grown+on+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix.</a> Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).</li>
<li>White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+modeling+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional modeling of ovarian cancer.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high+throughput+screening+using+a+primary+human+three-dimensional+organotypic+culture+predicts+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Comm%22%5BJournal%5D)">Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy.</a> Nature Comm. , (2015).</li>
<li>Sawada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Met+overexpression+is+a+prognostic+factor+in+ovarian+cancer+and+an+effective+target+for+inhibition+of+peritoneal+dissemination+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion.</a> Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).</li>
<li>Kenny, H. A., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP-2+functions+as+an+early+response+protein+in+ovarian+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis.</a> Cell cycle. 8, 683-688 (2009).</li>
<li>Sawada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+E-cadherin+promotes+ovarian+cancer+metastasis+via+alpha+5-integrin%2C+which+is+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target.</a> Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-independent+activation+of+c-Met+by+fibronectin+and+%CE%B1%285%29%CE%B2%281%29-integrin+regulates+ovarian+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis.</a> Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Um modelo organotípico do microambiente peritoneal foi criada para avaliar a função (s) individual e coletiva de ambos os componentes celulares e inatas do microambiente na disseminação do cancro do ovário. Os protocolos específicos para o plaqueamento e personalizar a cultura organotípico 3D para investigar ovário adesão célula cancerosa, proliferação e invasão são fornecidos. Células humanas primárias omentais mesoteliais e fibroblastos foram isoladas de pacientes e usado em uma passagem antecipada para preservar a mo...

O câncer de ovário é a malignidade ginecológica mais mortal1. A maioria dos pacientes é diagnosticada após o câncer ter se disseminado por toda a cavidade peritoneal. Uma vez que o câncer se espalhou por toda a cavidade peritoneal, a cirurgia citorredutora e a quimioterapia geralmente não são tratamento suficiente para prevenir a recorrência do câncer e a quimiorresistência, resultando em uma taxa de sobrevida de 5 anos inferior a 30%. A metástase do câncer de ovário é predominantemente limitada à cavidade peritoneal, e vários outros tipos de câncer, incluindo câncer gástrico, pancreático e de cólon, metastatizam para os mesmos locais anatômicos na cavidade peritoneal. Em geral, as células cancerígenas do ovário se desprendem do carcinoma in situ na trompa de Falópio ou no tumor ovariano primário, viajam no fluido peritoneal como células únicas ou esferoides e se ligam às superfícies revestidas de mesotélio do omento, intestino e parede abdominal2. 
O microambiente tumoral desempenha um papel importante na progressão da doença e na quimiorresistência em muitos tiposde câncer3-6. A cavidade peritoneal é um microambiente único, com uma monocamada de células mesoteliais cobrindo a maioria das superfícies (Figura 1A)7. O revestimento mesotelial atua como uma barreira que cria uma superfície de baixo atrito, que tende a proteger contra a adesão de células cancerígenas8. Imediatamente abaixo dessa superfície revestida de mesotelial há uma camada feita predominantemente de fibroblastos e matriz extracelular (MEC), que promovem a adesão e invasão de células cancerígenas8. As células do câncer de ovário secretam fatores que induzem alterações no revestimento das células mesoteliais que aumentam a adesão, invasão e metástase das células do câncer de ovário9,10. As células de câncer de ovário aderem à superfície mesotelial por meio de mecanismos mediados por integrina e CD44 (Figura 1B)11-16. 
Historicamente, vários modelos 3D foram desenvolvidos para investigar as interações do câncer de ovário com o microambiente. Alguns dos primeiros modelos estudaram a interface câncer de ovário-MEC17-21, câncer de ovário-comunicação de célulasmesoteliais 13,14,21-24 ou ambos25 (revisado por nós 26). Niedbala et al. descobriram que as células do câncer de ovário exibem uma adesão mais rápida e firme à ECM do que às células mesoteliais ou apenas ao plástico25. No entanto, esses modelos não se assemelhavam histologicamente ao microambiente peritoneal. Portanto, estabelecemos um modelo organotípico 3D para replicar mais completamente o microambiente do câncer de ovário. Para entender melhor o papel do microambiente e a interação entre o câncer e as células peritoneais na disseminação peritoneal do câncer de ovário, desenvolvemos um modelo de cultura organotípico in vitro 3D do revestimento da cavidade peritoneal (esquema na Figura 1C). O modelo proposto é composto por fibroblastos humanos primários e MEC, cobertos por uma camada de células mesoteliais humanas primárias - cada tipo de célula é isolado do omento humano. Histologicamente, esse modelo se assemelha ao revestimento peritoneal ou omental normal e fornece uma superfície na qual podemos estudar o microambiente tumoral, a interação entre as células cancerígenas e o tecido normal e os processos de adesão, invasão e proliferação das células cancerígenas8.

<table><tbody><tr><td><forte>1. Isolamento e cultura de células primárias</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3001304</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear de um gume</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de 15 cm</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro</td><td>?</td><td>?</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000044_3616914956</td><td></td></tr><tr><td>DMEM com L-Glutamina</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitaminas</td><td>Corning</td><td>25-020-Cl</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos não essenciais</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Shaker&nbsp;</td><td>Centrífuga Thermo-Fisher</td><td>MaxQ 4450</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Incubadora Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td> de CO2 com camisa de água <td>Thermo-Fisher</td><td>Forma Série II Modelo 3100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA, 1x (0,25%)</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>Worthington Bioquímica</td><td>LS002592</td><td></td></tr><tr><td>Frascos T-75</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>353136</tr><tr><td>Frascos T-175</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>P2, P10, P20, P200 e P1000</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta</td><td>Corning</td><td>Pontas filtradas P2, P10, P20, P200 e P1000</td><td></td></tr><tr><td>Nome do Reagente/ Equipamento</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários/Descrição</td></tr><tr><td>2. Cultura 3D de chapeamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>Invitrogen</td><td>Countess</td><td></td></tr><tr><td>Countess Celless Counting Chamber Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10313</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno Tipo I (Cauda de Rato)</td><td>BD Biosciences</td><td>354236 placa de</td><td></td></tr><tr><td>96 poços, fundo transparente, BD preto</td><td> Biosciences</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>Nome do Reagente/Equipamento</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo<</td><td>strong>Comentários/Descrição</td></tr><tr><td>3. Ensaio de adesão</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Eppendorf</td><td>Xplorer 300</td><td></td></tr><tr><td>Solução de paraformaldeído 4% em PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas</td><td>Molecular Devices</td><td>Minimax</td><td></td></tr><tr><td>Nome do Reagente/ Equipamento</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários/Descrição</td></tr><tr><td>5. Ensaio de invasão</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Inserts (8um, 24 poços)</td><td>BD Biosciences</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes de algodão</td><td>Cotonetes de cotonete</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200m</td><td></td></tr><tr><td>Cell Profiler</td><td>domínio público</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>BD Biosciences</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Nome do Reagente/Equipamento</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo<</td><td>strong>Comentários/Descrição</td></tr><tr><td>6. Anticorpos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Integrina &alfa; V&beta; 3 Anticorpo, clone LM609</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1976</td><td></td></tr><tr><td>Beta 1&nbsp;</td><td>Oncosynergy</td><td>OS2966</td><td></td></tr><tr><td>Alpha 5 [CD49e]</td><td>ID Pharmingen</td><td>555615</td><td></td></tr><tr><td>Beta 4 [CD104]</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB 2058</td><td></td></tr></tbody></table>

modelando os passos iniciais do cancro do ovário divulgação em uma cultura organotípicas do peritoneal cavity humano

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

O padrão de metástase do câncer de ovário é marcadamente diferente do da maioria dos outros tumores epiteliais, porque raramente se espalha hematogenamente. Em vez disso, as células de câncer de ovário esfoliadas do tumor primário são transportadas pelo fluido peritoneal para locais metastáticos dentro da cavidade peritoneal. Esses locais, principalmente o peritônio abdominal e o omento, são órgãos cobertos por uma superfície revestida de mesotélio. Para investigar os processos de disseminação do câncer de ovário, montamos um complexo sistema de cultura tridimensional que reconstrói o revestimento da cavidade peritoneal in vitro. Fibroblastos humanos primários e células mesoteliais foram isolados do omento humano. Os fibroblastos foram então misturados com matriz extracelular e cobertos com uma camada de células mesoteliais humanas primárias para imitar as superfícies peritoneal e omental encontradas por células de câncer de ovário em metástase. O modelo organotípico resultante é, como mostrado, usado para examinar os primeiros passos da disseminação do câncer de ovário, incluindo adesão, invasão e proliferação de células cancerígenas. Este modelo tem sido utilizado em vários estudos para investigar o papel do microambiente (celular e acelular) na disseminação precoce do câncer de ovário. Também foi adaptado com sucesso para triagem de alto rendimento e usado para identificar e testar inibidores de metástase de câncer de ovário.

A cultura organotípica foi montada misturando primeiro fibroblastos humanos primários com colagénio do tipo I e, em seguida, sobrepondo esta cultura com 5 vezes o número de células de mesotélio. A cultura foi incubada durante, pelo menos, 18 horas antes das células de cancro do ovário foram adicionados a estudar a adesão, invasão ou proliferação. Cada ensaio foi repetido com múltiplos (n = 3-5) culturas em 3D obtidas de diferentes pacientes e numerosos poços foram testados em cada condição para a adesão (n = 5), ensaios...

Aqui, apresentamos um protocolo para construir um modelo tridimensional in vitro do revestimento da cavidade peritoneal, composto por células mesoteliais humanas primárias e fibroblastos estratificados com matriz extracelular, como uma ferramenta para investigar a adesão, invasão e proliferação de células de câncer de ovário.

Modelando os passos iniciais do cancro do ovário Divulgação em uma cultura organotípicas do Peritoneal Cavity Humano

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...

O objetivo geral deste experimento é criar um modelo organotípico que imite o microambiente peritoneal para aprimorar nossa compreensão da biologia do câncer de ovário. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do câncer de ovário, como de que forma as interações entre células tumorais e o microambiente contribuem para a patogênese da doença, e como potenciais inibidores dessas interações podem ser testados. A principal vantagem desta técnica é o uso de células humanas primárias reais que formam o mesotélio, o qual reveste as superfícies da cavidade peritoneal, no co-cultivo com células de câncer de ovário.Embora este método possa fornecer informações sobre o câncer de ovário, ele também pode ser aplicado ao estudo de outros cânceres que se disseminam pela cavidade peritoneal, como os cânceres gástrico, pancreático e de cólon. Após a obtenção de um espécime cirúrgico humano de omento, imergir imediatamente a amostra em PBS à temperatura ambiente. Dentro de duas horas após a imersão, transferir o omento para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 20 mililitros de PBS fresco; transferir o restante da lavagem de PBS, que contém as células mesoteliais primári

modeling-early-steps-ovarian-cancer-dissemination-an-organotypic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O ensaio de depuração mesotelial descrito aqui leva vantagem das células marcadas com fluorescência e de microscopia de lapso de tempo de vídeo para visualizar e medir quantitativamente as interações de esferóides de câncer de ovário multicelulares e monocamadas de células mesoteliais. Este ensaio modela os passos iniciais da metástase do câncer de ovário.

Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

Heterotípica tridimensional<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelagem de Estroma-epitelial de ovário Interações durante o início e progressão do câncer

Neste vídeo, demonstramos o desenvolvimento de um modelo tridimensional in vitro do revestimento da cavidade peritoneal. Essa cultura organotípica pode ajudar a investigar a adesão, invasão e proliferação de células de câncer de ovário.

Modelagem de metástase de câncer de ovário no revestimento da cavidade peritoneal: um método para estabelecer um modelo 3D in vitro do revestimento peritoneal

Neste vídeo, estabelecemos uma cultura de órgãos omentais ex vivo sobreposta com células de câncer de ovário que expressam GFP para estudar a colonização do câncer de ovário dentro do explante omental. Este protocolo analisa estruturas de células imunes dentro do omento conhecidas como manchas leitosas que promovem metástases.

Modelagem da colonização de células de câncer de ovário do omento: um método ex vivo para estabelecer a colonização por manchas leitosas de células de câncer de ovário marcadas com fluorescência em explantes de omento murino

Invasão de células do cancro do ovário no revestimento mesotelial do peritoneu é um processo dinâmico ao longo do tempo. Utilizando um analisador de tempo real, a capacidade invasiva das células de câncer de ovário em uma célula modelo de co-cultura esferóide-mesoteliais podem ser quantificados durante períodos de tempo prolongados, fornecendo insights sobre os fatores que regulam o processo metastático.

Avaliação do cancro do ovário esferóide Apego e invasão de células mesoteliais em Tempo real

Descrevemos um protocolo que implementa abordagens in vivo e ex vivo para estudar a colonização do câncer de ovário dos tecidos adiposos peritoneais, particularmente o omento. Além disso, apresentamos um protocolo para quantificar e analisar estruturas de células imunes no omento conhecidas como manchas leitosas, que promovem metástases de tecido adiposo peritoneal.

In Vivo e Ex Vivo Abordagens para o Estudo do cancro do ovário metastático Colonização de Estruturas Láctea natural em Peritoneal adiposo

Para esclarecer o processo de várias etapas de difusão peritoneal de carcinoma dos ovários, o presente estudo apresenta um modelo experimental murino de desenvolvimento do tumor original e metástases através de inoculação peritoneal ortotópico com essas células tumorais.

Murino Experimental Modelo de desenvolvimento do tumor original e Peritoneal Metástase<em&gt; via</em&gt; Ortotópico injetar células do ovário Carcinoma

Para estudar a progressão do tumor do ovário num modelo fisiologicamente relevante, esferóides multicelulares foram cultivadas num microdispositivo sob fluxo de fluido simulado. Este modelo 3D dinâmica emula o ambiente intraperitoneal com os componentes celulares e mecânicas onde ocorre a metástase do cancro do ovário.

Modelagem do comportamento do cancro do ovário multicelular Spheroid em um microdispositivos 3D Peritoneal Dinâmico

Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo tridimensional (3D) ex vivo de interação célula-omento canceroso. O modelo fornece uma plataforma para elucidar mecanismos pró-tumorais dentro do nicho adiposo e para testar novas terapias.

Modelo Ex Vivo de Metástase Peritoneal de Câncer de Ovário Utilizando Omento Humano

Este protocolo detalha o desenvolvimento de modelos de camundongos com carcinoma seroso de ovário de alto grau (HGSOC) in vitro e in vivo. A partir da derivação de organoides das trompas de Falópio murina, sua modificação genética para recapitular a genética do HGSOC humano e sua introdução na bursa ovariana de camundongos singênicos para o desenvolvimento in vivo de tumores.

Desenvolvimento de Linhagens Organoides Derivadas de Camundongos a partir de Células Epiteliais da Trompa de Falópio para Modelagem de Carcinoma Seroso de Ovário de Alto Grau

Aprenda a construir um modelo organotípico tridimensional da cavidade peritoneal humana usando células mesoteliais primárias e fibroblastos. Este método permite estudar adesão, invasão e proliferação de células de câncer de ovário.

Modelando os passos iniciais do cancro do ovário Divulgação em uma cultura organotípicas do Peritoneal Cavity Humano

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