Modelando os passos iniciais do cancro do ovário Divulgação em uma cultura organotípicas do Peritoneal Cavity Humano

O objetivo geral deste experimento é criar um modelo organotípico que imite o microambiente peritoneal para melhorar nossa compreensão da biologia do câncer de ovário. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer de ovário, como como as interações entre as células cancerígenas e o microambiente contribuem para a patogênese da doença e como os inibidores potenciais dessas interações podem ser testados. A principal vantagem dessa técnica é que as células humanas primárias reais que formam as superfícies da linha de mesotélio da cavidade peral são usadas na co-cultura de células de câncer de ovário.

Embora esse método possa fornecer informações sobre o câncer de ovário, ele também pode ser aplicado ao estudo de outros cânceres que se disseminam por toda a cavidade peritoneal, como câncer gástrico, pancreático e de cólon. Após a aquisição de uma amostra cirúrgica de omento humano, mergulhe imediatamente a amostra em PBS à temperatura ambiente. Dentro de duas horas após a imersão, transfira o omento para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 20 mililitros de PBS fresco, transfira a lavagem restante do PBS contendo as células mesoteliais humanas primárias ou HPMC e glóbulos vermelhos para um novo tubo cônico de 50 mililitros e gire as células.

Em seguida, despeje o conteúdo do tubo em uma placa de cultura estéril de 10 centímetros e use dois bisturis para picar o tecido em pedaços de cinco milímetros cúbicos. Para isolar as células mesoteliais humanas primárias ou HPMC, transfira os pedaços de omento para um tubo cônico de 50 mililitros e aguarde um minuto. Para que as peças sólidas flutuem para o topo, o HPMC se depositará na parte inferior do tubo com os glóbulos vermelhos.

Use uma pipeta para transferir a lavagem de PBS contendo células mesoteliais e glóbulos vermelhos e para o tubo contendo as células peletizadas e girar as células. Em seguida, adicione 20 mililitros de PBS fresco ao omento e colete o PBS contendo HPMC e RB C3 mais vezes, o que acaba de ser demonstrado às células peletizadas originais. Após a placa de centrifugação final, as células em um frasco de 75 centímetros quadrados em 15 mililitros de meio de crescimento total.

Para isolar HPMC adicional da amostra de omento, agite o tecido sólido restante em 20 mililitros de PBS a 200 RPM e 37 graus Celsius. Após 10 minutos, deixe a amostra descansar por um minuto para permitir que o tecido sólido suba até o topo do tubo. Em seguida, colete o HPMC e as hemácias do fundo do tubo, conforme demonstrado.

Agora, gire as células dessa lavagem secundária e coloque-as em um frasco separado de 75 centímetros quadrados em 15 mililitros de meio de crescimento total. Para isolar qualquer HPMC restante, agite o tecido por mais 10 minutos, desta vez em uma mistura de PBS e 10 mililitros de tripsin EDTA e coloque esses HPMC e RBC em um frasco de 75 centímetros quadrados, em seguida, incube as culturas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em um ambiente umidificado, alimentando as células plaqueadas com 15 mililitros de fresco, meio de crescimento total nos dias três e cinco sem remover o meio gasto. O HPMC pode ser identificado por sua forma cuboidal e sua expressão de citoqueratina oito e menton.

Para isolar os fibroblastos normais do omento, trate o tecido picado restante do omento com 10 mililitros de solução de colagenase tipo três 10 recém-preparada diluída em meio livre de soro por seis horas com agitação no final do período de incubação, o tecido digerido terá se tornado opaco com a solução contendo alguns detritos fibrosos, centrifugue a suspensão normal de fibroblastos de omento, e depois cultura. As células em 13 mililitros de meio de crescimento total. Após 24 horas, substitua o meio antigo por 15 mililitros de meio de crescimento completo fresco.

Os fibroblastos normais do omento podem ser identificados por sua forma plana e alongada, sua expressão de vimentina e sua falta de citoqueratina auxiliam na expressão. Para liberar os fibroblastos normais do omento da cultura, lave o frasco de cultura com 10 mililitros de PBS, seguido de três mililitros de tripsina por não mais que cinco minutos. Quando as células se desprenderem, neutralizar a tripsina com pelo menos três vezes o volume do meio de crescimento total e transferir as células para um tubo cónico de 50 mililitros.

Gire as células e ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio de crescimento total. Em seguida, conte as células e dilua-as para duas a quatro vezes 10 elevado ao terceiro fibroblasto por 100 microlitros de crescimento total, concentração média. Em seguida, adicione 0,5 microgramas por 100 microlitros de colágeno de cauda de rato, um às células e coloque 100 microlitros de células por poço em uma placa de fundo preto transparente de 96 poços.

Em seguida, transfira a placa para uma incubadora de cultura de células por pelo menos quatro horas ou até que as células adiram à superfície da placa, enquanto os fibroblastos de momento normal estão se acomodando. Separe o HPMC de seus frascos de cultura e dilua essas células para uma a duas vezes 10 elevado ao quarto HPMC por 50 microlitros de meio de crescimento total. Em seguida, adicione 50 microlitros de HPMC por poço aos fibroblastos de omento normais anexados e retorne a placa à incubadora de cultura de células por pelo menos 18 horas antes do experimental.

Use a semente do dia seguinte, as coculturas 3D ORGANOTÍPICAS com células de câncer de ovário que expressam GFP de uma cultura confluente de 80 a 90% na diluição apropriada para o ensaio a jusante desejado, o peptídeo RGD e anticorpos bloqueadores contra o alfa cinco, beta um e alfa cinco. Beta três. As integrinas inibem a adesão das células do câncer de ovário à cultura organotípica, enquanto o peptídeo RAD e os anticorpos controle e beta quatro integrina não.

O peptídeo RRG D e os anticorpos bloqueadores contra a integrina alfa cinco e beta um também inibem a proliferação de células de câncer de ovário na cultura organotípica, enquanto o peptídeo RAD e os anticorpos de controle alfa cinco, beta três e beta quatro integrina não. Além disso, o peptídeo RGD e os anticorpos bloqueadores contra a integrina alfa cinco e beta um inibem a invasão da cultura 3D ORGANOTÍPICA das células cancerígenas do ovário. Enquanto o anticorpo integrina alfa cinco beta três melhora esse processo conforme esperado dos dados do ensaio de adesão e proliferação, o peptídeo RAD e os anticorpos controle e beta quatro integrina também não exibiram efeito na invasão de células cancerígenas.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em sete a 12 horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de sempre usar um gabinete de segurança biológica e o equipamento de proteção adequado, incluindo jaleco e luvas após este procedimento. Outros métodos, como ensaios de adesão, invasão e proliferação, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre as interações das células cancerígenas com o microambiente após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do câncer de ovário explorarem como o microambiente influencia as interações das células cancerígenas com as células da cavidade peritoneal humana. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células primárias do momento humano e como construir uma cultura organotípica do revestimento peral.